CIK對耐藥腫瘤細胞的殺傷作用

趙鑫 常穎 劉玉俠 王寶 盧衛平 王啟文

(1吉林省腫瘤醫院，吉林 長春 130012；2吉林省腫瘤防治研究所)

手術、化療、放療是惡性腫瘤治療的常規手段。大多數惡性腫瘤病人需要進行化療。隨著治療的進行，大部分病人逐漸出現對化療藥物不敏感，即腫瘤細胞對化療藥物產生耐受，影響治療效果。本實驗通過體外誘導建立耐藥細胞模型，并用細胞因子活化的殺傷細胞(CIK細胞)對其進行殺傷實驗，為化療后腫瘤病人耐藥提供治療方法。

1 材料與方法

1.1材料 順鉑(cDDP)：江蘇豪森藥業股份有限公司；淋巴細胞分離液：天津灝洋生物制品科技責任有限公司；IMDM培養基：GIBCO公司；胎牛血清：天津康源公司；白細胞介素(IL)-2：北京四環生物制藥有限公司；抗CD3抗體：Biolegend公司。抗人CD3-FITC，抗人CD16、CD56-PE：BD公司；干擾素(IFN)-γ：天津灝洋生物制品科技責任有限公司：噻唑藍(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)：Sigma公司。人食道癌細胞株Ecap-109：吉林省腫瘤防治研究所保存。

低溫高速離心機：SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養箱：Thermo Scientific公司；流式細胞儀：BD公司；全自動酶標儀：芬蘭雷勃公司。

1.2建立人食道癌細胞株Ecap-109耐藥模型 將凍存的Ecap-109細胞復蘇，放至細胞培養瓶培養至對數生長期，加終濃度為50 μmol/L的cDDP至培養瓶，1 h后將含cDDP的培養液倒掉，換成新的不含cDDP的培養液，每天觀察細胞變化，待細胞長滿后用0.25%胰酶消化后分瓶，繼續培養至對數生長期，每瓶重新加入終濃度為50 μmol/L的cDDP，如此反復誘導6次后，做cDDP耐藥實驗。

1.3耐藥實驗 將誘導6次的Ecap-109 細胞和正常Ecap-109 細胞計數，均為5×104/ml，加到96孔細胞培養板，100 μl/孔。細胞貼壁后加入不同濃度(100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μmol/L)的cDDP，培養72 h。培養結束前4 h加MTT，培養結束，小心吸去上清，加150 μl DMSO，用酶標儀測OD值，波長492 nm，計算不同濃度cDDP對兩種細胞的抑制率，并計算誘導的耐藥細胞及正常細胞的IC50值和耐藥指數。

1.4CIK細胞的培養鑒定 見參考文獻〔1〕。

1.6統計學處理 應用SPSS17.0軟件計算IC50，計量數據兩組比較采用配對t檢驗。

2 結 果

2.1CDDP對誘導的耐藥Ecap-109細胞和正常Ecap-109細胞的抑制率及IC50 見表1。CDDP誘導6次后的Ecap-109細胞對其抑制率明顯低于正常Ecap-109細胞，IC50值(70.869 μmol/L)也明顯高于正常Ecap-109細胞(20.561 μmol/L)，差異有統計學意義(P<0.01)，耐藥指數達到了3.45。

2.2CIK對耐藥Ecap-109細胞和正常Ecap-109細胞殺傷活性 CIK組、CIK+耐藥Ecap-109組、耐藥Eap-109組、CIK+Ecap-109組、Ecap-109組的殺傷活性分別為：2.243±0.062，2.715±0.139，2.413 ±0.195，2.682±0.044，2.548±0.045。以上結果顯示，CIK細胞對耐藥Ecap-109細胞和正常Ecap-109細胞的殺傷活性(80.43%，83.0%)沒有顯著差別(P>0.05)，證明CIK細胞可以殺傷耐藥腫瘤細胞。

表1 耐藥Ecap-109細胞和正常Ecap-109細胞耐藥檢測結果

3 討 論

腫瘤細胞對化療等抗腫瘤藥物產生耐藥是造成治療失敗的主要原因之一。針對腫瘤細胞耐藥，目前的處理對策包括尋找耐藥細胞誘導分化方法、尋找ABC轉運蛋白抑制劑、促進耐藥細胞凋亡等〔2〕，采用的方法有使用腫瘤耐藥逆轉劑，如三苯氧胺、托瑞米芬、miRNA〔3，4〕等。

腫瘤細胞產生耐藥的原因有多種，其中化療后殘存的腫瘤干細胞(CSCs)是引起轉移和復發的主要原因之一〔5〕。CSCs如同其他干細胞一樣，具有無限自我更新能力，它就像一粒種子，在適合的條件下會無限增殖，而且會通過多種機制產生耐藥〔6〕。

食道癌是我國常見的惡性腫瘤之一，目前主要治療方法是手術、化療、放療等。同其他腫瘤一樣，在進行手術后化療過程中，以及一部分晚期病人化療進行中，部分病人隨著治療的進行會產生對化療藥的耐藥，影響治療效果。

鉑類藥物是最常用的腫瘤化療藥物，所以由其引起的耐藥比較多，而且還會出現交叉耐藥。針對這一現狀，本文建立了食道癌耐cDDP的耐藥細胞株Ecap-109，以此為基礎，探討CIK細胞對耐藥細胞的殺傷作用。CIK是具有T淋巴細胞抗腫瘤活性和自然殺傷(NK)細胞無主要組織相容性復合物(MHC)限制性的抗腫瘤細胞，它可以同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，又被稱為NK樣T淋巴細胞〔7，8〕，由于它的這些特征，它可以通過釋放腺病毒顆粒直接殺傷腫瘤，同時分泌抗腫瘤細胞因子IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-2等調節免疫系統而間接殺傷腫瘤，同時誘導細胞凋亡，保持持續抗腫瘤活性，目前對其抗腫瘤作用研究較多〔9〕。本研究結果說明CIK細胞可以用于耐藥腫瘤病人的治療。