姜黃素對阿爾茨海默病小鼠的治療作用

孫冬梅

(長春醫學高等專科學校基礎醫學部組胚教研室，吉林 長春 130031)

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關的神經系統原發性退行性病變，也是一種神經毒性損傷病變〔1,2〕。臨床主要表現為進行性精神狀態衰變，包括記憶障礙、情感障礙、認知障礙及社交障礙等，發病近年呈上升趨勢〔3,4〕。目前西醫對AD尚無有效治療藥物且西藥長期服用副作用顯著〔1，5〕，因此本實驗研究采用姜黃素治療，探究姜黃素對AD小鼠記憶能力、腦組織神經細胞損傷程度、凋亡程度、腦組織中β-淀粉樣(Aβ)和磷酸化tau(Ptau)蛋白的陽性表達強度及mRNA水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物來源及分組 實驗動物野生C57BL/6和轉基因APP/V717雌性小鼠，體質量(23.4±1.2)g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，合格證SCXK(遼)2015-0001。實驗分為對照組(C57BL/6野生雌性小鼠，n=10)、AD模型組(APP/V717轉基因雌性小鼠，n=10)和姜黃素治療組(APP/V717轉基因雌性小鼠，n=10)，三組均給予正常飲食。

1.2實驗試劑及儀器設備 姜黃素購于上海遠慕生物科技公司；鼠抗Aβ和Ptau蛋白抗體購于Abcam公司；SP9710和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物技術有限公司；Tunnel熒光凋亡試劑盒購于長春鼎國生物有限公司；Trizol購于Invitrogen公司；Taq酶、DL 2000 marker和RT-PCR反轉錄試劑盒購于塔克拉公司；引物由上海生物工程有限公司提供。實時熒光定量PCR儀(ABI7300，Biotek公司，美國)；Biometra PCR擴增儀(Biotek公司，美國)；Morris水迷宮(Panlab公司，西班牙)；OLYMPUS BX51和BX53顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)。

1.3給藥方式和劑量 對照組和模型組每天灌胃一次生理鹽水0.1 ml，姜黃素治療組每天灌胃一次姜黃素0.1 ml(50 mg/kg)，共治療8 w。

1.4實驗標本采集和檢測指標

1.4.1各組小鼠記憶能力 在實驗結束前5 d，通過Morris水迷宮連續訓練4 d，第5天測試潛伏期，觀察小鼠記憶能力是否有改善。

1.4.2各組小鼠腦組織神經細胞損傷程度 三組小鼠在治療12 w結束后，處死取腦組織，常規石蠟包埋，制備3.5 μm切片4張，一張通過蘇木素-伊紅(HE)染色普通光學顯微鏡下觀察腦組織神經細胞損傷程度及攝取圖片。

1.4.3各組小鼠腦組織神經細胞凋亡程度 3.5 μm石蠟切片一張，通過Tunnel染色熒光顯微鏡下觀察腦組織神經細胞凋亡程度及攝取圖片，連續觀察200倍5個視野，計數神經細胞凋亡百分率。

1.4.4各組小鼠腦組織中Aβ和Ptau mRNA水平 Trizol提取腦組織總RNA，每個樣本基因擴增3次，行實時熒光定量PCR檢測Aβ和Ptau mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平。

1.4.5各組小鼠腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽性表達強度 3.5 μm石蠟切片兩張，分別通過免疫組織化學染色觀察Aβ和Ptau蛋白陽性表達強度，陽性表達呈棕黃色斑塊，細胞核用蘇木精復染為藍色。通過連續觀察200倍5個視野，計數陽性斑塊。

1.5統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組Morris水迷宮測試潛伏期比較 與對照組比較，模型組潛伏期明顯延長(P<0.05)；姜黃素治療組潛伏期略延長(P>0.05)，但較模型組明顯縮短(P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織神經細胞損傷程度比較 HE染色可見對照組小鼠腦組織無神經胞損傷，姜黃素治療組小鼠腦組織神經細胞固縮壞死較模型組明顯減輕，見圖1。

2.3各組腦組織神經細胞凋亡程度比較 Tunnel染色可見姜黃素治療組小鼠腦組織神經細胞凋亡數量較模型組明顯減少，較對照組略有增多；通過連續觀察200倍5個視野，計數凋亡細胞百分率差異均有統計學意義(均P<0.05)；見圖2，表1。

表1 各組Morris水迷宮潛伏期、腦組織中神經細胞凋亡百分率及Aβ和Ptau蛋白陽性斑塊數比較

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

圖1 各組腦組織病理學觀察(HE，×200)

圖2 各組腦組織Tunnel染色(×200)

2.4各組腦組織Aβ和Ptau mRNA水平比較 實時熒光定量PCR檢測可見姜黃素治療組小鼠腦組織中Aβ mRNA(9.38±2.24)和Ptau mRNA(7.53±2.39)水平均較模型組Aβ mRNA(27.56±6.19)和Ptau mRNA(16.86±6.47)明顯降低，較對照組Aβ mRNA(3.12±0.98)和Patu mRNA(2.09±0.82)略有增多,差異均有統計學意義(均P<0.05)。

2.5各組腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽性表達強度比較 免疫組織化學染色可見姜黃素治療組小鼠腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽性表達強度均較模型組明顯降低，較對照組略有增多；通過連續觀察200倍5個視野，計數陽性斑塊差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖3，表1。

圖3 各組腦組織Aβ、Ptau蛋白免疫組織化學染色(DAB，×200)

3 討 論

隨著社會進步人口老齡化、生活壓力及日常不良生活習慣的增加，AD死亡率和發病率都在逐年的上升〔6,7〕。姜黃素是從草本植物姜黃根莖中提取出的一種多酚類化合物，以往研究表明姜黃素具有較好的生理活性，能夠降血脂、抗炎、抗腫瘤、清除自由基及在癡呆領域里有著潛在意義〔2，8〕。本實驗結果表明姜黃素在提高AD小鼠空間學習記憶能力方面作用顯著。

AD的病理基礎是Aβ在腦組織神經元細胞外的異常沉積和tau蛋白Ptau增多引起的神經纖維纏結〔9,10〕。Aβ和Tau蛋白的異常，尤其是Tau蛋白的異常與AD發病機制緊密相關〔11〕。Aβ是一種神經毒性物質，它可引起氧化應激，刺激腦組織產生4-羥基壬烯酸和過氧化氫(H2O2)，導致神經細胞凋亡；Aβ的沉積會形成老年斑，老年斑中的大量銅、鐵等金屬離子與Aβ作用又產生H2O2，進一步介導AD患者腦組織的氧化損傷〔12〕。Tau蛋白在神經退行性病變的誘導中最為關鍵，它與細胞有絲分裂、細胞內物質轉運有關，是一種微管相關蛋白，通常以磷酸化和去磷酸化兩種形式存在，二者保持平衡狀態〔3，13～15〕；Tau蛋白位于17染色體長臂，是一種磷酸基蛋白，通常含有2～3個磷酸基，當Tau蛋白異常過度磷酸化時常含有5～9個磷酸基，喪失刺激微管聚集的生物學功能成為毒性分子，這些過度磷酸化的Tau蛋白破壞正常微管系統，自身聚集形成神經纖維纏結，引起神經元功能損傷發生腦神經退行性病變〔16,17〕。本實驗結果表明姜黃素能顯著提高AD小鼠空間學習記憶能力；它可能通過降低腦組織神經細胞凋亡程度及Aβ和Ptau基因水平對AD小鼠具有明顯的治療效果，其作用機制和作用通路有待于進一步探討。