補腎益肝活血方含藥血清對ERK/p38MAPK信號通路的影響

許駿 謝林

(南京中醫藥大學附屬省中西結合醫院骨傷科，江蘇 南京 210000)

骨關節炎(OA)屬于中醫學痹證的范疇，好發于老年人，以軟骨退變和關節周圍骨質增生、細胞外基質(ECM)代謝失調為主要的病理特征，軟骨變性是OA的最基本病理改變，臨床上表現為關節的疼痛、僵硬、肥大及功能活動受限等〔1〕。臨床上應用補腎益肝活血方治療OA療效顯著，取得良好臨床效果，并通過實驗探討了該方對軟骨細胞凋亡、骨髓基質細胞(BMSCs)分化的影響，發現補腎益肝活血方有抑制軟骨細胞凋亡的作用，其含藥血清能有效誘導BMSCs成軟骨細胞分化，其作用機制很可能與細胞外信號調節激酶(ERK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)存在相關聯系。本研究旨在分析補腎益肝活血方對OA ERK/p38MAPKs信號通路產生的影響，探究OA發生機制及OA治療中的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 選取健康的、成年SPF級雌性SD大鼠，重量185～230 g，實驗用動物全部由南京中醫藥大學研究所提供。為了使這些大鼠適應周圍環境，納入本實驗的所有SD大鼠均于實驗前1 w放置在實驗室內，飼養員進行常規的分籠飼養。實驗室基本指標：保持自然光照，良好的通風，室內溫度要求控制在18.5～23.0℃，濕度控制在40%～70%。實驗研究期間，所有大鼠進食標準顆粒詞料，并可以自由地飲用自來水，術前8 h禁食水。

1.1.2主要試劑、儀器與藥品 胎牛血清(FBS，Gibco公司)；DMEM低糖培養基(Hyclone公司)；雙抗混合液(100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，10%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶(Sigma 公司)；逆轉錄試劑盒(Fermentas 公司)；引物合成(上海生工生物工程公司)；磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38抗體(Anti-p-p38α，Thr180/Tyr182)一抗(Millipore 公司)；p38一抗(Millipore 公司)。二氧化碳培養箱、熒光倒置顯微鏡、流式細胞儀、酶標儀、濾器、無菌操作臺和高速離心機。補腎益肝活血方由骨碎補15 g、丹參10 g、沒藥10 g及懷牛膝10 g組成，實驗所用藥物由南京中醫藥大學附屬省中西結合醫院藥劑科提供。

1.2實驗動物分組 40只雌性 SD 大鼠隨機分為 4組，即對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各 10只。

1.3補腎益肝活血方含藥血清的制備 根據人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表換算，給藥組給予補腎益肝活血方3.2 g/(kg·d)灌胃，對照組則給予等量的生理鹽水灌胃。各組每12 h灌胃給藥1次，連續灌胃 5 d。并在最后一次灌胃前禁食，末次灌藥3 h后，麻醉SD大鼠，行腹主動脈采血，靜置于溫度預調在4℃的冰箱4 h后，離心機設置2 500 r/min的轉速，離心25 min，分離離心所得血清，將同組實驗動物分離所得到的血清予以混合，并在56℃水浴箱內，滅活30 min，抽濾、除菌后分裝，-20℃保存備用。

1.4軟骨細胞體外培養與鑒定

1.4.1軟骨細胞分離、原代培養 軟骨細胞分離步驟：①選取12只新生SD乳大鼠(48 h內)行脫頸法處死，浸泡75%乙醇5 min，放在無菌手術臺上；②用眼科剪和鑷子分離大鼠肋骨處的軟骨，分離以后，放入活力碘伏內浸泡3 min；③準備好培養皿，將浸泡好的軟骨轉移至超凈臺，將殘余軟組織剔除，轉移至新的培養皿內，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，棄上清。軟骨細胞原代培養步驟：①第一次酶解：將清洗干凈的軟骨轉移到中號培養皿內，加入10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶；②用眼科剪將軟骨塊剪至1 mm以內的小塊，使用移液器，將其充分混勻，使細胞分散后放置于二氧化碳培養箱中，培養溫度設為37℃，5%二氧化碳，在飽和濕度的條件下培養24 h；③軟骨塊消化至80%，取細胞懸液于離心管，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入8 ml完全培養基，細胞計數后以104接種于培養皿；④第二次酶解：培養達24 h后換液，此后每48 h換液一次，細胞傳代前使用倒置顯微鏡觀察，當細胞面積達80%以上時，用10%的胰蛋白酶消化后進行細胞傳代。

1.4.2軟骨細胞的鑒定 (1) 細胞形態觀察：每天在顯微鏡下對細胞的生長情況進行觀察，使用胰蛋白酶將細胞消化為懸液以后取出50 ml，使用細胞計數板進行計數后記錄，在1 w以內不傳代。(2)甲苯胺藍染色：軟骨細胞內的多聚糖可被甲苯胺特異性的染色，因此軟骨細胞的鑒定通常都使用甲苯胺藍染色。首先，將培養好的軟骨細胞用蒸餾水沖洗3～5遍，并將軟骨細胞浸泡在1.5 ml的甲苯胺藍染液內，浸泡3 min，再用蒸餾水清洗3次，最后使用無水乙醇對其進行脫水作用，光鏡下觀察并拍照。(3)免疫組織化學染色：將體外培養的軟骨細胞接種在蓋玻片上，連續培養7 d后取出，首先，使用PBS將蓋玻片清洗輕輕沖洗3次后，使用4%多聚甲醛處理30 min，按照鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)法說明進行Ⅱ型膠原酶的染色，對照組使用PBS替代一抗。

現場還有一塊示范田，將南京農業大學的多項技術進行了集成應用，包括智能化育秧、秸稈綠色綜合利用、機插—施肥—除草一體化、大田精確定量綠色智慧管理等技術，基本實現了全程機械化、綠色化、智能化生產，一個“智慧農場”的雛形已清晰可見。

1.5退變軟骨細胞模型的建立及含藥血清干預 當培養的軟骨細胞傳至第2代時，予軟骨細胞10 ng/ml的白細胞介素(IL)-1β 誘導獲得退變的軟骨細胞；持續 24 h 的誘導退變以后，棄去培養液，換成4 種不同的培養體系分別進行培養。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組上清中IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達情況 細胞培養的上清液使用ELISA試劑盒檢測IL-1β的水平，嚴格根據說明書上面的操作步驟進行，即分步驟進行包板、洗板、加樣品、密封室溫搖床孵育等過程。

1.7Western印跡法檢測含藥血清干預后退變軟骨細胞中磷酸化(p)-ERK1/ERK2、p-p38MAPKs 及基質金屬蛋白酶(MMP)-3蛋白表達

1.7.12 h含藥血清干預結束后，退變軟骨細胞中總蛋白的提取 ①首先，用RIPA裂解液中和苯甲基磺酰氟(PMSF)(100 mmol/L)，按100∶1的比例混勻，置于冰上備用。②棄去經IL-1β誘導退變的軟骨細胞得培養液，加入預冷的PBS，漂洗2次，去除PBS，向每一個培養瓶中加入RIPA裂解液，混和均勻，放置在冰上30 min。③待軟骨細胞充分裂解后，使用細胞利刀將細胞刮下來，轉移至預冷的 EP管中，12 000 r/min，4℃離心10 min。④將上清液轉移至預冷的新 EP管中，預留10 μl用于蛋白濃度測定。⑤每根 EP管中蛋白上清與蛋白定量緩沖液按4∶1的比例混勻，置于100℃加溫機中加熱5 min使蛋白質變性、分裝，-80℃保存備用。

1.7.2Western印跡法檢測蛋白表達 (1)配膠：按照表1的反應物和12%分離膠及5%濃縮膠的液體量進行配膠。(2)灌膠：預先將玻板洗滌干凈，并安裝好備用，確認沒有漏水，進行灌膠，首先將12%的分離膠灌入玻璃板，然后使用正丁醇將分離膠的上層壓成一平面。等到分離膠凝固了，把正丁醇倒掉，用蒸餾水沖洗干凈，同時再用濾紙把膠面頂層殘留的蒸餾水洗凈，最后把濃縮膠灌入，與此同時，迅速地插入梳子，使其在室溫下凝固。

表1 分離膠和濃縮膠的配制

(3) 加樣：往每一個孔內加樣的量相同，都是40 μg的蛋白，每孔上樣量蛋白濃度為40 μg，依次把待測樣品上樣，在膠左側加入5 μl的蛋白 Marker。(4)電泳：讓濃縮膠在80 V的電壓下進行電泳，當染料跑至分離膠的時候，可以將電壓改為100 V，也可以不改，電泳繼續進行。(5)檢測蛋白：①電泳過后，取下一塊膠，轉移到一個盛有考馬斯亮藍(CBB)的容器內，注意切勿將其弄碎或破損；②搖床染色，時間為20 min，染色完畢，收回染色液；③運用脫色液進行脫色，脫至蛋白條帶清晰可見，然后用雙蒸餾水沖洗，3～5次為宜，最后CBB染色。(6) 轉膜：①預處理：先將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜浸泡在無水甲醇中，保持10 min，提前剪好轉膜所需的海綿和濾紙，并將其與浸泡過的PVDF膜一同放入內裝轉膜緩沖液的托盤中，再次浸泡15 min；②轉膜：按照順序依次放好，將電轉夾夾好，并將電轉夾插進裝滿轉膜緩沖液的電泳槽內，電泳槽置于盛有冰塊的泡沫塑料盒內，在100 V電壓下進行轉膜55 min；③封閉：當轉膜完畢后，取出PVDF膜，浸泡于封閉液中，閉封于室溫下2 h；④一抗孵育：將PVDF膜放入一抗稀釋液(CyclinD1，1∶400；CDK4，1∶400；pRb，1∶500；p16，1∶600)，4℃搖床孵育過夜；⑤二抗孵育：次日一早將PVDF膜取出，沖洗10 min×3次。最后再把膜放入二抗稀釋液中，孵育1 h，沖洗10 min×3次。 (7)成像與結果分析：參照電化學發光(ECL)試劑盒的說明書，按 A液：B液為1∶1，置于1.5 ml的 EP管內充分混合均勻，將其滴在膜的蛋白面，室溫下放置1 min。凝膠成像儀下顯影、拍照。并用分析凝膠圖像的相應軟件分析不同種蛋白的表達量及與內參的比值。

1.8統計學分析 采用SPSS13.0進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

圖1 倒置顯微鏡下接種后不同階段大鼠軟骨細胞的形態變化(×100)

72 h 時，軟骨細胞大部分貼壁，分裂增殖速度增快。培養的軟骨細胞胞質較豐富，可見清晰的胞核，有 1～2個核仁(圖1B)；約 4 d左右匯合成單層鋪滿整個培養皿底面(圖1C)；傳代后生長速度加快，約4 d左右便開始傳代，細胞周圍可見具有折光性的ECM，細胞長成一片，呈“鋪路石”狀外觀( 圖 1D) ；當傳代傳至第5代時，細胞的形態逐漸有所變化，部分變為長梭形，同時也會出現形態不規則的細胞(圖1E)；當軟骨細胞培養至第 7 代以后，絕大部分細胞呈梭形，生長速度減慢，傳代周期亦延長(圖1F)。

2.2軟骨細胞的鑒定結果 甲苯胺藍染色后可見細胞核呈深藍色，有 1～2 個核仁，胞質呈淡藍色，細胞外基質著淺藍色，見圖2。軟骨細胞的胞質經異硫氰酸熒光素(FITC)染色后發出鮮亮的綠色熒光，呈強陽性，細胞核區域沒有著色。細胞核經4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后激發出藍色熒光。從圖3可以看出，幾乎全部細胞表達了 Ⅱ型膠原，進一步證明本實驗得到了純度很高的軟骨細胞。

圖2 甲苯胺藍染色(×100)

圖3 Ⅱ型膠原免疫熒光染色(×100)

2.3軟骨細胞的生長曲線 1～3代軟骨細胞生長速度相差不大，當傳至第4代以后，細胞增殖速度變慢。 MTT比色法顯示，第2代軟骨細胞的生長曲線近似“ S ”形。第1～3天處于生長潛伏期，第4～8天軟骨細胞呈對數生長，約在第9～10天達到平臺期，至第11天開始出現生長抑制，見圖4。

圖4 第2代軟骨細胞的生長曲線

2.4補腎益肝方對IL-1β、TNF-α表達的影響 低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α表達水平均顯著低于對照組(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 補腎益肝活血方對軟骨細胞IL-1β、TNF-α表達的影響

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；表3同

2.5補腎益肝方對軟骨細胞ERK、p38MAPK表達的影響 低、中、高劑量組ERK、p38MAPK與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 補腎益肝活血方對軟骨細胞ERK、p38MAPK表達的影響

3 討 論

OA是一種退行性變的疾病，好發于老年人，據統計，我國40歲以上人群原發性OA患病率為46.3%〔2〕。OA的特征性改變是軟骨的退變和關節周圍骨質的增生，實驗室表現為進行性的關節軟骨破壞和骨贅的形成，軟骨變性是OA的最基本病理改變〔3，4〕。OA可同時伴有不同程度的滑膜炎癥，最終可以出現關節的疼痛、僵硬、肥大及功能活動等受到限制〔5，6〕。關節軟骨的退變與破壞是OA 最主要的病理環節，軟骨組織內只有一種細胞成分，就是軟骨細胞，而軟骨細胞在體內不增殖〔7，8〕。為了本研究的進一步進行，本研究采用體外實驗的實驗方法，用SD雌性大鼠肋骨的軟骨細胞進行體外細胞培養。

軟骨細胞在維持關節軟骨的正常結構和功能方面發揮重要的作用，當軟骨細胞受到外力或TNF、表皮細胞生長因子(EGF)及IL-1等促炎細胞因子刺激后，便會通過細胞內的ERK1/2、p38MAPK等信號轉導通路，把信號傳遞給各種細胞內的轉錄因子，并通過對酪氨酸和蘇氨酸雙位點磷酸化、酶與酶之間互相作用或通過MAPK在受體結合部位相互影響的能力激活MAPKs通路〔9，10〕，從而影響MMPs的表達，最終導致關節軟骨細胞肥大和ECM代謝失調〔11，12〕。有研究提出〔13〕IL-1參與了OA ECM丟失的全過程，并通過實驗證明，向實驗動物模型的關節內注射IL-1并檢測蛋白多糖，IL-1可以誘導蛋白多糖的丟失，表明IL-1受體阻滯劑可使動物模型OA軟骨的破壞得到延緩，證實了IL-1在OA發生發展過程中的功能?？寺〔⒓兓驣L-1可以誘導MMP的表達、能夠促使分解代謝等因子還有其他炎癥因子等的表達，這也是IL-1作用于軟骨細胞致使OA發生發展的機制所在〔14〕。前列腺素(PG)E2具有刺激Ⅱ型膠原基因表達而抑制Ⅰ型膠原基因表達的作用，研究發現，當IL-1刺激軟骨細胞導致Ⅱ型膠原基因表達被抑制、Ⅰ型膠原的生成被上調，PGE2的生成則會增加，這正是機體的負反饋機制的體現〔15〕。研究表明，IL-1能夠協同抑瘤素(OS)M刺激軟骨細胞產生蛋白多糖酶和MMPs〔16〕。因此，本研究運用IL-1β誘導軟骨細胞，建立退變的軟骨細胞模型。

關于p38MAPK及其信號轉導通路的研究，研究證實，p38MAPK信號轉導通路是軟骨細胞退化及關節軟骨破壞過程當中主要的信號傳導途徑之一〔17〕。第一，軟骨細胞退變中 IL-1β 激活了p38MAPK信號通路〔18〕；第二，p38MAPK信號通路參與了MMPs 過度表達，進而加劇了軟骨細胞的退變，如Roth等〔19〕研究結果表明 OA 患者關節液中MMP-3 過表達，應用 p38MAPK 信號通路阻滯劑后可以顯著降低 MMP-3 的表達;第三，該信號轉導通路參與了關節軟骨細胞凋亡〔20〕。

近年來，關于單味中藥及中藥經方、中藥復方治療OA的實驗研究逐漸成為研究熱點，同時中藥治療OA的療效較為確切。研究發現，中醫藥治療OA的機制較為復雜，涉及細胞內信號轉導的各個環節，包括抑制細胞因子的釋放、抑制軟骨細胞的凋亡、促軟骨細胞的增殖、抑制NO合成、下調MMPs水平，使關節軟骨的代謝恢復平衡〔21〕。補腎益肝活血方治療肋骨關節炎，取得良好臨床效果。前期實驗研究發現，補腎益肝活血方能夠誘導BMSCs成軟骨細胞分化，參與軟骨細胞增殖和凋亡的信號轉導，推測其作用機制很可能與MMP-3和纖維蛋白樣細胞外基質蛋白(EFEMP)-1這兩個激酶存在一定的聯系。

中醫認為，OA屬中醫“痹證”、“傷筋”范疇，由于汗出當風，或涉水冒寒，或居處潮濕，致使風、寒、濕等邪氣痹組經脈，阻滯經絡、氣血的運行，屬本虛標實證，以肝腎不足，精血虧損為本，而外來的風、寒、濕邪氣及痰、瘀等病理產物為標。

痹證在臨床治療中，常見的有如下三個證型：①風寒濕痹；②風濕熱痹；③痰瘀痹阻及久痹正虛。當痹證病程日久者，可出現痰瘀痹阻氣血不足及肝腎虧虛。補腎益肝活血方中骨碎補入肝、腎經，具有補肝強腎，有治本之功，是為君藥，；丹參，活血化瘀，消腫除脹，是為臣藥；沒藥，活血散瘀、消腫止痛，是為佐藥；懷牛膝，活血化瘀，同時補肝腎、強筋骨，引藥下行，是為佐藥，全方共奏補腎益肝、活血化瘀、消腫止痛之功。

補腎益肝活血方主要針對OA肝腎虧虛、風寒濕痹阻的共性病機，具有補益肝腎，蠲痹止痛之功效，臨床療效確切。前期研究發現該方有抑制軟骨細胞凋亡的作用，其含藥血清能有效誘導BMSCs分化成軟骨細胞，其作用機制與MMP-3的表達存在相關性。研究表明，MMP-3的表達是由ERK1/2 和P38MAPK信號通路介導〔22～24〕。

綜上，本研究結果表明補腎益肝活血方可通過調節ERK、p38 MAPK的表達，使退化的軟骨細胞恢復正常。