老年膿毒癥患者轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad信號通路、炎癥因子及外周血microRNA-155和-466的表達(dá)及意義

潘田君 袁盛偉

(1臺州市中心醫(yī)院 臺州學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 臺州 318000；2浙江省舟山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科)

膿毒癥是創(chuàng)傷、燒傷、感染等急危患者的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，其病情較為兇險，可發(fā)展為多器官衰竭、嚴(yán)重膿毒癥、膿毒癥休克等，其發(fā)病率和病死率較高，嚴(yán)重威脅患者生命安全〔1,2〕。因此，采取早期、正確診斷能夠改善膿毒癥預(yù)后〔3〕。全身炎性反應(yīng)綜合征是膿毒癥的病理生理變化主要表現(xiàn)〔4〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號從細(xì)胞膜傳入細(xì)胞核，與基因表達(dá)耦聯(lián)，主要依賴Smads家族蛋白調(diào)節(jié)，其中Smad蛋白是TGF-β信號通路中關(guān)鍵步驟。隨著近年來關(guān)于TGF-β/Smad信號通路的不斷研究，其在膿毒癥中的作用越來越受到關(guān)注〔5〕。微小RNA(microRNA)與多種疾病發(fā)生、生理及病理過程密切相關(guān)。相關(guān)研究表明，膿毒癥外周血中microRNA可于一定程度上反映機(jī)體炎癥情況，從而判定疾病嚴(yán)重程度〔6〕。本研究探討老年膿毒癥患者TGF-β/Smad信號通路、炎癥因子及外周血microRNA-155和microRNA-466的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇臺州學(xué)院附屬醫(yī)院于2014年6月至2017年12月收治的老年膿毒癥患者87例，男52例，女35例；年齡65～75〔平均(70.89±5.71)〕歲；其中膿毒癥組27例，男16例，女11例，平均年齡(71.02±5.46)歲，嚴(yán)重膿毒癥組34例，男20例，女14例，平均年齡(70.57±4.71)歲，膿毒癥休克組26例，男16例，女10例，平均年齡(70.83±6.41)歲。另選擇同期健康體檢者50例作為對照組，男31例，女19例；年齡65～74〔平均(70.75±4.27)〕歲。各組性別(χ2=0.891)，平均年齡(F=0.473)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。所有研究對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1TGF-β/Smad信號通路檢測 所有研究對象于入院12 h內(nèi)采取外周靜脈血3 ml，以離心半徑15 cm，2 500 r/min，離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清TGF-β1、Smad2和Smad7水平。

1.2.2炎癥因子檢測 包括降鈣素原(PCT)、白細(xì)胞介素(IL)-23和C反應(yīng)蛋白(CRP)，所有研究對象采取外周靜脈血3 ml，以離心半徑15 cm，2 500 r/min，離心10 min，分離血清，采用免疫發(fā)光夾心法檢測PCT含量，采用ELISA檢測IL-23含量，采用酶速率散射比濁法檢測CRP含量。

1.2.3外周血microRNA-155和microRNA-466表達(dá)檢測 所有研究對象采取外周靜脈血3 ml，采用TRIzol一步法提取總RNA，操作步驟嚴(yán)格按照美國Invitrogen公司TRIzol試劑盒檢測。總RNA的吸光度值采用紫外分光光度計測定。由上海生工生物工程股份有限公司合成引物。反應(yīng)總體積25 μl。反應(yīng)條件：95℃ 15 min預(yù)變性，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共35個循環(huán)。microRNA-155和microRNA-466相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。

1.3觀察指標(biāo) ①觀察各組急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分系統(tǒng)(APACHE)Ⅱ評分和序貫器官功能障礙評分(SOFA)變化；②觀察各組TGF-β/Smad信號通路變化；③觀察各組炎癥因子變化；④觀察各組外周血microRNA-155和microRNA-466表達(dá)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t、F及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較 見表1，膿毒癥休克組、嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分均明顯高于對照組，膿毒癥休克組明顯高于嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥組，且嚴(yán)重膿毒癥明顯高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組TGF-β/Smad信號通路水平比較 見表2，膿毒癥休克組、嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥組TGF-β1、Smad2和Smad7水平均明顯高于對照組，膿毒癥休克組明顯高于嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥組，且嚴(yán)重膿毒癥明顯高于高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組炎癥因子水平比較 見表2，膿毒癥休克組、嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥組PCT、IL-23和CRP水平明顯高于對照組，膿毒癥休克組明顯高于嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥組，且嚴(yán)重膿毒癥明顯高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組外周血microRNA-155和microRNA-466表達(dá)比較 見表3，膿毒癥休克組、嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥組外周血microRNA-155和microRNA-466表達(dá)明顯高于對照組，膿毒癥休克組明顯高于嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥組，且嚴(yán)重膿毒癥明顯高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較分)

與對照組比較：1)P<0.05；與膿毒癥組比較：2)P<0.05；與嚴(yán)重膿毒癥組比較：3)P<0.05，下表同

表2 各組TGF-β/Smad信號通路、炎癥因子水平比較

表3 各組外周血microRNA-155和microRNA-466表達(dá)比較

3 討 論

隨著有創(chuàng)操作的不斷發(fā)展及多發(fā)傷的增多，膿毒癥的發(fā)病率呈上升趨勢，已嚴(yán)重威脅人類健康。膿毒癥病情變化迅速，并且預(yù)后較差〔7～10〕。因此，臨床上針對膿毒癥患者采取及時有效的診斷和治療尤為重要〔11～13〕。

TGF-β主要是一種由多細(xì)胞分泌的多功能生長因子。相關(guān)研究報道顯示，TGF-β參與膿毒癥的發(fā)生且在下調(diào)炎癥中具有重要作用〔14〕。TGF-β可下調(diào)膿毒癥炎癥級聯(lián)反應(yīng)，對抗炎癥反應(yīng)過度，降低前炎癥因子釋放，對機(jī)體具有一定保護(hù)作用。相關(guān)研究表明，體外TGF-β可阻斷前炎癥因子以及膿毒癥血清誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞抑制〔15〕。同時TGF-β還可抑制一氧化氮合酶(NOS)2轉(zhuǎn)錄的活性，從而降低一氧化氮生成。一氧化氮過度產(chǎn)生是誘導(dǎo)膿毒癥休克發(fā)生的關(guān)鍵介質(zhì)，可引起心肌細(xì)胞收縮力降低、血管收縮劑反應(yīng)性下降及血管病理性擴(kuò)張等病理改變。Smad蛋白家族介導(dǎo)TGF-β受體激活后獨特的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

PCT為降鈣素的前肽，主要由116個氨基酸組成。血清中PCT半數(shù)半衰期為20～24 h。當(dāng)出現(xiàn)膿毒癥時，PCT水平顯著上升。通常當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)毒素刺激3～4 h后，PCT則被釋放進(jìn)入循環(huán)，并且其水平在8～24 h后達(dá)到高峰，認(rèn)為PCT可作為診斷危重癥患者感染的一種有效標(biāo)志物，并且可用于監(jiān)控膿毒癥的病情變化〔16〕。IL-23作為異源性二聚體蛋白，主要來源于活化的樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，且具有多種生物學(xué)功能。IL-23還可作用于分化成熟的Th17細(xì)胞，促進(jìn)IL-17蛋白的分泌。研究報道顯示，膿毒癥患者血清IL-23水平明顯高于健康體檢者〔17〕。CRP主要由肝臟合成，其在機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷及感染時顯著上升，在炎癥刺激的4～6 h內(nèi)，其水平可由于細(xì)胞因子刺激而顯著上升，在36～50 h達(dá)到最高峰。相關(guān)研究報道顯示，膿毒癥患者血清CRP水平顯著高于健康體檢者〔18〕。

microRNA在參與炎癥疾病病理生理過程及維持機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)等方面具有意義〔19,20〕。microRNA-155是近年來研究熱點，且認(rèn)為其為膿毒癥炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)的平衡點參與病理生理過程，認(rèn)為其能夠作為診斷診斷的一種敏感指標(biāo)，且可為膿毒癥接受基因治療及免疫調(diào)理的重要靶點。研究報道顯示，體內(nèi)microRNA-155表達(dá)與膿毒癥免疫失衡程度相關(guān)，且對膿毒癥病情程度具有一定預(yù)警作用〔21〕。而目前關(guān)于microRNA-466研究甚少。

本研究表明，TGF-β/Smad信號通路，炎癥因子PCT、IL-23和CRP及外周血microRNA-155和microRNA-466表達(dá)可能參與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展，且與病情進(jìn)展密切相關(guān)，有助于診斷和指導(dǎo)治療。