右美托咪定對(duì)體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)患兒外周血中性粒細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

郭瓊梅，劉秀葉，王莉，周曉輝，魏硯硯，毛瑞芬

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031)

體外循環(huán)(CPB)過(guò)程中中性粒細(xì)胞被大量激活，誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)和全身炎癥反應(yīng)，造成組織損傷。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑可通過(guò)降低體外循環(huán)患兒圍術(shù)期白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平而減輕全身炎癥反應(yīng)[1]。凋亡是中性粒細(xì)胞從炎性部位清除的主要方式。研究表明，CPB過(guò)程中血漿促炎癥因子的增加與中性粒細(xì)胞凋亡減少呈正相關(guān)，中性粒細(xì)胞凋亡減少與其細(xì)胞膜上死亡受體(Fas)表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞內(nèi)B細(xì)胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[2]。右美托咪定是高選擇性α2受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗交感作用，而人中性粒細(xì)胞膜可表達(dá)α2受體[3]。研究證實(shí)，右美托咪定可以減輕CPB患兒的全身炎癥反應(yīng)[4,5]。而右美托咪定對(duì)CPB過(guò)程中性粒細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。本研究對(duì)此作了探討，為臨床減輕CPB炎癥反應(yīng)提供依據(jù)。

1 資材料與方法

1.1 臨床資料 2015年10月～2016年7月本院收治的室間隔缺損患兒60例，均于CPB下行心內(nèi)直視修補(bǔ)術(shù)，男29例、女31例，年齡4～8歲，體質(zhì)量14～28 kg，ASA分級(jí)Ⅱ、Ⅲ級(jí);排除近1個(gè)月內(nèi)急性感染、肝腎功能異常，重度貧血、近3個(gè)月內(nèi)用皮質(zhì)激素治療。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為對(duì)照組(C組)、右美托咪定組(Dex組)，各30例。C組男15例、女15例，年齡(5.2±1.3)歲，體質(zhì)量(19±5)kg；Dex組男14例、女16例，年齡(5.0±1.2)歲，體質(zhì)量(21±7)kg。兩組臨床資料具有可比性。研究已獲本院倫理醫(yī)學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。

1.2 麻醉方法 入室前30 min肌注東莨菪堿0.01 mg/kg。肌注氯胺酮4～6 mg/kg后入室，監(jiān)測(cè)血壓、心率、血氧飽和度，開(kāi)放外周靜脈通路，行橈動(dòng)脈穿刺置管，持續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓。麻醉誘導(dǎo)：靜脈注射咪唑安定0.15 mg/kg、舒芬太尼1 μg/kg、依托咪酯0.3 mg/kg、羅庫(kù)溴銨0.6 mg/kg誘導(dǎo)，氣管插管后行機(jī)械通氣，氧流量2 L/min，潮氣量10～12 mL/kg，吸呼比1∶2，維持PETCO2為35～45 mmHg。行右頸內(nèi)靜脈穿刺置管。麻醉維持：間斷靜脈注射舒芬太尼0.5～1 μg/kg、羅庫(kù)溴銨0.3～0.6 mg/kg，持續(xù)輸注丙泊酚4～6 mg/(kg·h)。CPB采用WEL-1000人工心肺機(jī)(天津匯康醫(yī)用設(shè)備有限公司)和ODMO-100型膜式氧合器(西安岱岱生物醫(yī)學(xué)工程有限責(zé)任公司)。羥乙基淀粉130/0.4、壓積紅細(xì)胞、冷凍血漿等預(yù)充，晶膠比(0.4～0.6)∶1。動(dòng)脈流量80～120 mL/(kg·h)，術(shù)中維持MAP為40～60 mmHg。麻醉誘導(dǎo)后Dex組給予初始劑量0.5 μg/kg的鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司)給藥時(shí)間>10 min，繼之以0.4 μg/(kg·h)的速率維持至術(shù)畢。C組給予等容量生理鹽水。記錄兩組主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、CPB時(shí)間。

1.3 標(biāo)本采集 分別于CPB開(kāi)始前(T1)、CPB開(kāi)始后30 min(T2)、CPB停止后30 min(T3)和CPB停止后24 h(T4)采集橈動(dòng)脈血5 mL，其中3 mL經(jīng)肝素抗凝后，以3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，-20 ℃保存。

1.4 中性粒細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞膜上Fas表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)檢測(cè) 采用Percoll密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞，瑞氏染色檢驗(yàn)分離細(xì)胞的純度，臺(tái)盼蘭檢驗(yàn)細(xì)胞活性。用流式細(xì)胞儀觀測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡率。另外取各時(shí)點(diǎn)全血100 μL加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的Fas熒光單克隆抗體，溶血素裂解紅細(xì)胞，同時(shí)用鼠抗人PE標(biāo)記IgG 2aκ作同型陰性對(duì)照，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。將分離的中性粒細(xì)胞懸于含10%胎小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，破膜后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Bcl-2熒光單克隆抗體，同時(shí)用鼠抗人FITC標(biāo)記IgG 2aκ作同型陰性對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 兩組主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、CPB時(shí)間比較 C組主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、CPB時(shí)間分別為(50±24)、(61±21)min，Dex組主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、CPB時(shí)間分別為(42±25)、(58±24)min。兩組主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、CPB時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 兩組各時(shí)間點(diǎn)中性粒細(xì)胞凋亡率、Fas、Bcl-2表達(dá)比較 與T1比較，兩組T2、T3、T4時(shí)中性粒細(xì)胞凋亡率均降低(P均<0.05)，T3時(shí)最低(P均<0.05)，Dex組T4時(shí)恢復(fù)至CPB開(kāi)始前水平(P>0.05)；與C組比較，Dex組T3、T4時(shí)中性粒細(xì)胞凋亡率高(P均<0.05)。與T1比較，兩組Fas陽(yáng)性表達(dá)率T3、T4時(shí)均降低(P均<0.05)，T3時(shí)達(dá)最低(P均<0.05)；與C組比較，Dex組T3、T4時(shí)Fas陽(yáng)性表達(dá)率高(P均<0.05)。與T1比較，兩組中性粒細(xì)胞內(nèi)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率T2、T3、T4時(shí)均升高(P均<0.05)，T3時(shí)達(dá)最高(P均<0.05)；與C組比較，Dex組在T2、T3、T4時(shí)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組中性粒細(xì)胞凋亡率、Fas、Bcl-2表達(dá)比較

2.3 相關(guān)分析 C組、Dex組中性粒細(xì)胞凋亡率均與CPB時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.686、-0.675，P均<0.05)；C組、Dex組中性粒細(xì)胞膜上Fas陽(yáng)性表達(dá)率與中性粒細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r分別為0.589、0.694，P均<0.05)；C組、Dex組中性粒細(xì)胞內(nèi)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率與中性粒細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.592、-0.725，P均<0.05)。

3 討論

中性粒細(xì)胞是機(jī)體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，在炎癥早期階段發(fā)揮重要的免疫防御作用，但過(guò)度的炎性反應(yīng)會(huì)損傷正常的組織細(xì)胞。適時(shí)抑制中性粒細(xì)胞過(guò)強(qiáng)的效應(yīng)或促進(jìn)其凋亡有利于減輕炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷。CPB過(guò)程中，血液與人工裝置非生物表面直接接觸、手術(shù)創(chuàng)傷、器官缺血再灌注、術(shù)中體溫的改變以及血流動(dòng)力學(xué)的急劇改變，可迅速啟動(dòng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。血液中炎癥介質(zhì)大量增加，中性粒細(xì)胞被大量激活并釋放彈性蛋白酶，造成組織細(xì)胞損傷，同時(shí)釋放炎癥因子，激發(fā)全身炎癥反應(yīng)，造成多器官功能衰竭[1]。

凋亡是中性粒細(xì)胞從炎性部位清除的主要方式，且對(duì)周圍組織損傷最小。研究證實(shí)，CPB過(guò)程中，中性粒細(xì)胞凋亡率降低，并與CPB時(shí)間相關(guān)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[6]。本研究中，兩組中性粒細(xì)胞凋亡率在CPB開(kāi)始后的30 min最低。而右美托咪定組高于對(duì)照組，說(shuō)明右美托咪定減少了CPB過(guò)程中中性粒細(xì)胞的凋亡，可能與右美托咪定的抗炎作用相關(guān)，研究表明，右美托咪定可以抑制CPB過(guò)程中核因子B(NF-κB)的活性，降低白細(xì)胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等促炎因子的水平[7]。而IL-8、TNF-α等促炎因子可以通過(guò)不同的途徑抑制中性粒細(xì)胞凋亡。NF-κB通過(guò)調(diào)控多種炎癥介質(zhì)及與凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來(lái)參與調(diào)控中性粒細(xì)胞的凋亡[8,9]。吳新海等[3]研究結(jié)果表明，右美托咪定對(duì)離體中性粒細(xì)胞的凋亡促進(jìn)和呼吸爆發(fā)功能的抑制作用呈劑量依賴性，同時(shí)該研究是針對(duì)正常情況下的中性粒細(xì)胞，而不是過(guò)度炎癥刺激狀態(tài)。因此，臨床常用劑量的右美托咪定不影響正常狀態(tài)下中性粒細(xì)胞的凋亡，不影響機(jī)體的免疫防御，不增加手術(shù)患者的感染概率。而在本研究中CPB過(guò)度炎癥反應(yīng)狀態(tài)下，右美托咪定加速了過(guò)度激活的中性粒細(xì)胞的凋亡。

中性粒細(xì)胞凋亡的途徑主要包括外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑。Fas是一種膜結(jié)合蛋白，是腫瘤壞死因子受體超家族成員。中性粒細(xì)胞通過(guò)表達(dá)Fas及其配體(FasL)，調(diào)控細(xì)胞凋亡，保持自身數(shù)量的穩(wěn)定[10]。促炎因子IL-8通過(guò)抑制Fas和FasL的結(jié)合，抑制中性粒細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，CPB開(kāi)始后兩組中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜上的Fas陽(yáng)性表達(dá)率均降低，且與中性粒細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，而右美托咪定組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)率較對(duì)照組高。說(shuō)明右美托咪定可能通過(guò)Fas/FasL途徑上調(diào)CPB過(guò)程中中性粒細(xì)胞的凋亡率。

Bcl-2家族包括促凋亡和抗凋亡兩類蛋白，成熟的中性粒細(xì)胞兩種蛋白均有表達(dá)，CPB過(guò)程中NF-κB的激活導(dǎo)致抗凋亡蛋白表達(dá)增加。Bcl-2是抗凋亡基因，被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞凋亡的最后通路之一，通過(guò)阻止線粒體釋放的細(xì)胞色素C等凋亡形成因子發(fā)揮抗凋亡作用[10,11]。本研究結(jié)果顯示，CPB開(kāi)始后至停止24 h，中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2表達(dá)升高，右美托咪定組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)較對(duì)照組降低。說(shuō)明右美托咪定通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改善CPB導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞凋亡。

綜上所述，右美托咪定通過(guò)上調(diào)中性粒細(xì)胞膜上Fas表達(dá)和下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)，減輕了CPB過(guò)程中中性粒細(xì)胞凋亡的抑制。本研究不足之處在于樣本量小，同時(shí)需進(jìn)一步探討不同劑量右美托咪定對(duì)CPB心內(nèi)直視手術(shù)患兒外周血中性粒細(xì)胞凋亡的影響。