非小細胞肺癌組織miR-155、PDCD4表達變化及意義

韓昕，白維君

(遼寧省腫瘤醫院，沈陽110042)

肺癌是全球范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤，近年來我國肺癌發病率逐年增高，雖然手術、放化療及新的靶向治療藥物不斷發展，患者病死率仍較高，5年生存率低[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的病理類型，目前仍缺乏有效的早期篩查手段，大部分患者發現時已為中晚期，預后較差[2]。因此有必要深入研究NSCLC發生發展的分子機制。微小RNA(miRNA)是非編碼RNA調控因子，長度為18～25個核苷酸，參與多種細胞信號傳導通路的調控，在炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病中發揮重要的生物學作用[3]。miR-155在乳腺癌、肺癌、膀胱癌等腫瘤組織中異常表達，與患者總體生存期有關[4]。有研究表明，miR-155可結合并抑制抑癌基因VHL、TP53INP1等的表達，并促進核因子κB(NF-κB)、Janus酪氨酸蛋白激酶2/轉錄激活因子3(STAT3)通路的激活，導致腫瘤細胞增殖和遠處轉移[5]。程序性細胞死亡因子4(PDCD4)基因位于人類染色體10q25.2，具有抑癌基因的作用，其編碼的PDCD4蛋白能結合并抑制真核翻譯起始因子4A(eIF4A)的解旋酶活性，抑制腫瘤細胞核糖體的蛋白合成過程，促進腫瘤細胞凋亡[6]。目前對NSCLC組織中miR-155與PDCD4的表達變化研究較少。本研究通過檢測NSCLC組織中miR-155、PDCD4的表達，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年2月～2017年12月于本院就診并行手術治療的NSCLC患者60例，男34例，女26例；年齡41～62(52.1±6.3)歲；肺腺癌39例，鱗狀細胞癌(鱗癌)21例；TNM分期[7]：Ⅰ期15例、Ⅱ期20例，Ⅲ期20例，Ⅳ期5例；組織分化程度：高分化19例，中分化10例，低分化31例；伴淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移32例。納入標準：均經術后病理檢查診斷為NSCLC；既往未接受過免疫治療、化療等；臨床資料完整。排除標準：合并急性感染性疾病(急性胃腸炎、呼吸道感染等)、其他惡性腫瘤病史、嚴重的肝肺等臟器功能不全。本研究經本院倫理委員會審核批準，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 癌組織及癌旁組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術。術中收集癌組織及其癌旁正常組織(距離癌組織邊緣3 cm以上)，置于凍存管內液氮罐中速凍，于-80 ℃冰箱保存。取組織約100 mg，分別應用總RNA提取試劑盒(RNAiso Plus，9108，Takara)及miRNA isolation試劑盒(RNAiso for Small RNA，9753A，Takara)提取組織中總RNA。紫外分光光度法鑒定RNA溶液的濃度及純度，-80 ℃冰箱保存。以總RNA為模板，分別用cDNA合成試劑盒(One Step PrimeScript RT-PCR Kit,RR064, Takara )合成cDNA。嚴格按照反轉錄試劑盒說明書進行操作。miR-155特異性莖環正向引物序列：5′-CGGCGGTTTAATGCTAATCGTGAT-3′，反向引物序列：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；以U6作為內參，上游引物序列:5′-CGGCGGTCGTGAAGCGTTCCAT-3′，下游引物序列：3′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-5′。PDCD4上游引物序列：5′-ATGTGGAGGAGGTGGATGTG-3′，下游引物序列：5′-TGGTGTTAAAGTCTTCTCAAATGC-3′；以β-actin作為內參，上游引物序列：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物序列：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′。miR-155的總反應體系20 μL，包括cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、PCR Master MixⅡ 10 μL、TaqMan miRNA assay 1 μL、RNse free水6 μL。PDCD4總反應體系25 μL，包括cDNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL、上下游引物各0.1 μL、10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，加雙蒸水補充至25 μL。qRT-PCR反應條件：95 ℃ 3 min;95 ℃變性12 s、62 ℃退火50 s、72 ℃延伸10 s，共40個循環。反應均在ABI2500 qRT-PCR儀上完成，每個樣本重復3次。用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達比較 癌組織與癌旁組織中miR-155相對表達量分別為3.342±0.784、0.651±0.192，PDCD4 mRNA相對表達量分別為0.133±0.021、1.153±0.352。癌組織中miR-155相對表達量高于癌旁組織(t=26.244，P=0.000)，PDCD4 mRNA相對表達量低于癌旁組織(t=22.347，P=0.000)。

2.2 癌組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理參數的關系 癌組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達與腫瘤分期及組織學分級有關(P均<0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤病理類型、直徑及淋巴結轉移無關(P均>0.05)。見表1。

表1 癌組織中miR-155、PDCD4 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理參數的關系

2.3 NSCLC組織中miR-155與PDCD4 mRNA表達的相關性 NSCLC組織中miR-155相對表達量與PDCD4 mRNA相對表達量呈負相關(r=-0.618，P=0.000)。

3 討論

80%～85%的肺癌為NSCLC，而NSCLC中鱗癌和腺癌最為常見[8]。雖然近年來診斷和治療技術取得較大發展，但NSCLC患者的5年生存率仍較低[9]，因此需深入研究其發病機制。非編碼RNA如LncRNA、miRNA等在腫瘤的發生和進展中發揮重要作用，通過調控細胞信號傳導及靶基因的表達，影響腫瘤細胞增殖、分化、凋亡及浸潤轉移等生物學行為[10]。miRNA是一類小的非編碼RNA，是轉錄后基因調控的主要參與者，可結合靶基因mRNA的3′非編碼區，影響mRNA的穩定性和基因表達。miRNA在正常生理和病理條件下均起重要的調控作用。腫瘤細胞內的miRNA可促進腫瘤相關基因(p65、STAT3等)的表達，同時能抑制抑瘤基因(PTEN、VHL等)的表達，在腫瘤增殖、凋亡、浸潤轉移、腫瘤干細胞特性維持、腫瘤代謝、腫瘤血管生成及免疫逃逸等多個方面發揮重要的調控作用。在NSCLC組織中已檢測出多種miRNA表達異常，如miR-155、miR-133b等，檢測其表達有助于NSCLC的早期診斷、治療及預后評估[11]。其中miR-155可結合SOCS1、SOCS6和PTEN等基因mRNA的3′非編碼區，直接抑制抑瘤基因的表達，發揮促進腫瘤發生發展的生物學效應。

PDCD4作為一種細胞凋亡相關基因，能編碼長度約469個氨基酸，其氨基端的α螺旋結構區能結合翻譯起始因子eIF4A的N端，通過抑制核糖體復合物形成，影響蛋白合成。其在凋亡誘導過程中表達上調，而在直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中均發現其表達下調[12]。現已證實多種miRNA能調控PDCD4表達，如胰腺癌組織中miR-429能促進腫瘤細胞中PDCD4表達[13]，而在NSCLC組織中miR-21可調控PI3K/AKT/mTOR信號通路，抑制PDCD4表達[14，15]。而目前NSCLC中miR-155與PDCD4的關系報道較少，有必要深入研究。

本研究癌組織中miR-155的相對表達量高于癌旁組織，與以往研究[16]報道一致。目前miR-155高表達的機制尚不明確，可能與其編碼基因miR-155HG啟動子區的表觀遺傳學修飾，如乙酰化修飾后的激活有關[17]。尚有研究顯示，長鏈非編碼RNA(如XIST)能作為內源競爭性RNA結合miR-155，抑制miR-155對下游癌基因TERF1、CDX1等表達的影響，抑制腫瘤細胞增殖和轉移，而腫瘤發生時XIST基因表達降低，對miR-155的抑制作用減弱[18]。此外，本研究NSCLC癌組織中miR-155的表達與腫瘤分期、組織學分級有關，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化的癌組織中miR-155表達高。表明癌組織中miR-155表達與NSCLC的發生發展有關。研究表明，miR-155高表達能夠激活PI3K/SGK3/β-catenin信號通路，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化(EMT)，進而促進腫瘤的局部浸潤和遠處轉移，導致患者預后不良[19]。本研究癌組織中miR-155與PDCD4的表達呈負相關，其機制可能為PDCD4是miR-155的靶基因，miR-155能夠結合PDCD4 mRNA的3′非編碼區，通過降低PDCD4 mRNA穩定性，干擾PDCD4的翻譯。而在體外細胞實驗中沉默miR-155表達后，PDCD4表達增加，并抑制腫瘤細胞的浸潤和侵襲[20]。

本研究癌組織中PDCD4 mRNA相對表達量低于癌旁組織，其原因一方面與PDCD4基因5′CpG島的高甲基化影響基因轉錄有關；另一方面小非編碼RNA降低PDCD4 mRNA的穩定性，在翻譯水平降低其表達。此外，PDCD4能結合并抑制NF-κB p65的活性，抑制轉錄因子STAT3及下游靶基因表達，當PDCD4表達減少后，STAT3促進miR-181b表達，進一步抑制PDCD4表達，形成一條負反饋環路。本研究NSCLC組織中PDCD4的表達與腫瘤分期、組織學分級有關，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化癌組織中PDCD4表達低。表明PDCD4可能參與NSCLC發生發展的過程。目前其機制尚不明確，其原因可能為PDCD4表達越低，與轉錄因子twist1的DNA結合域的結合減少。twist1活化下游靶基因如Vimentin的表達，抑制E-鈣黏素的表達，促進腫瘤細胞發生EMT，進而促進腫瘤的浸潤和轉移。

綜上所述，NSCLC組織中miR-155表達升高，而PDCD4表達降低，兩者共同參與NSCLC的發生發展，有可能成為NSCLC診斷、治療及預后評估的腫瘤標志物，但兩者之間的具體機制有待進一步研究。