姜黃素腹腔注射對哮喘小鼠的防治作用及其機制

周好好，黃翠萍

(1湖北醫(yī)藥學院，湖北十堰442000；2湖北科技學院)

哮喘是一種免疫功能異常的變態(tài)反應性疾病，氣道炎癥是其發(fā)病機制之一。微小RNA-155(miR-155)是位于人類第21號染色體的BIC基因外顯子3編碼的一種多功能RNA，其與癌癥、免疫性疾病等相關(guān)[1]，與哮喘氣道炎癥關(guān)系密切。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路可通過介導細胞凋亡、促進各種細胞因子的合成和炎癥細胞的募集等,在哮喘的發(fā)生中起至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素是天然植物多酚化合物，可有效緩解氣道阻塞、氣道高反應性和炎癥細胞浸潤等[2,3]。姜黃素可誘導腫瘤細胞內(nèi)miRNA表達發(fā)生變化，其是否影響miR-155-5P的表達尚未可知，在哮喘發(fā)病過程中對p38 MAPK信號通路作用的研究也較少。2017年10月～2018年3月，本研究觀察了姜黃素腹腔注射對哮喘小鼠的防治作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級雌性健康BALB/c小鼠28只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：11400700254656，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g。雞卵清蛋白(OVA)(德國Sigma公司，純度62%～88%)，4%氫氧化鋁凝膠(西安赫特生物科技有限公司，500 mL)，Mmu-miR-155-5p探針法RT-PCR試劑盒(GenePharma公司)，兔抗p38、兔抗磷酸化p38(CST)。402AI超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設備有限公司)，多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)，RT-PCR儀(美國Bio-Tek公司)，3-18K高速冷凍離心機(德國Sigma公司)。

1.2 動物分組、模型制備及藥物干預 28只小鼠適應環(huán)境7 d后隨機分為正常對照組、模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組，每組7只。模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組根據(jù)文獻[4]分致敏和激發(fā)兩個階段制備哮喘模型。第0、7、15天致敏3次，正常對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射致敏液(含OVA 4 mg+氫氧化鋁150 μL)0.2 mL。第22～27天為激發(fā)階段，將小鼠置于霧化箱內(nèi)(20 cm×20 cm×30 cm)，每天霧化40 min，正常對照組用生理鹽水溶液作為霧化溶液，其余各組使用10% OVA生理鹽水作為激發(fā)液。每次激發(fā)前30 min，正常對照組、模型組腹腔注射生理鹽水0.3 mL，姜黃素低、高劑量組分別腹腔注射100、200 mg/kg姜黃素各0.3 mL。觀察各組哮喘發(fā)作表現(xiàn)。

1.3 標本采集及處理 各組末次激發(fā)24 h后，10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射0.1 mL麻醉，處死小鼠，取其右肺門中葉，用生理鹽水沖洗，經(jīng)10%多聚甲醛固定24 h，做3 μm厚切片，用于蘇木素-伊紅染色，觀察形態(tài)學變化，其余肺組織用生理鹽水沖洗后，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.4 肺組織病理變化觀察 采用HE染色法。取出10%多聚甲醛固定的肺組織，經(jīng)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片脫蠟后，用蘇木素染液染色，分化漂洗，伊紅復染，透明封固，風干后中性樹膠封片。于倒置相差顯微鏡下(200倍)觀察各組氣道結(jié)構(gòu)有無破壞，氣道壁及氣道平滑肌是否增厚，支氣管壁及血管壁周圍有無炎癥細胞浸潤。

1.5 肺組織中miR-155-5p表達檢測 用RT-PCR法。檢測試劑盒購自GenePharma，按說明書進行操作。TRIzol法提取RNA，反應體系(RNA 2 μL+Random N6 5 μL)加熱70 ℃ 5 min，放于冰盒上，反應物體系20 μL：dNTP 0.75 μL+5×MMLV RT Buffer 4 μL+MMLV Reverse Transcriptase 0.2 μL+ Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，反應條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。聚合酶鏈反應：miR-155-5p引物購自吉瑪基因股份有限公司，用GAPDH做參照，反應體系20 μL：cDNA 2 μL、2×Real-time PCR Master Mix 10 μL、miRNA&U6 snRNA specific primer set 0.4 μL、miRNA&U6 snRNA specifir probe 0.4 μL、ROX Reference 校準染料(50×)0.4 μL、Taq DNA 聚合酶(5U/μL)0.2 μL+Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)6.6 μL。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.6 肺組織中磷酸化p38 MAPK蛋白表達檢測 采用Western blotting實驗。取凍存的肺組織50 mg，放入勻漿器于冰上進行碾壓，加入400 μL裂解液(RIPA 1 mL+PMSF 10 μL+磷酸酶抑制劑10 μL)冰上裂解30 min，將裂解液移至1.5 mL離心管中，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清即為總蛋白,-20 ℃保存?zhèn)溆茫珺CA法測蛋白濃度。將提取的蛋白加入蛋白上樣緩沖液，放入沸水中10 min，變性完后冷卻至室溫再放入-20 ℃保存。上樣蛋白量40 μg，5%濃縮膠、12%分離膠進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，磷酸化p38 MAPK用1%～3%的BSA浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。一抗磷酸化p38 MAPK(1∶1 000)，于4 ℃搖床孵育過夜，次日室溫下洗膜，HRP標記羊抗兔二抗(1∶50 000)，37 ℃搖床孵育2 h。TBST洗膜，DAB顯色。以β-actin做參照，用多功能酶標儀測定各條帶吸光度(OD)值作定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組哮喘發(fā)作表現(xiàn)比較 致敏階段，各組表現(xiàn)均無異常。激發(fā)階段，模型組出現(xiàn)打噴嚏、搔鼻、安靜少動、點頭樣喘息等典型的哮喘癥狀，而姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組哮喘癥狀不明顯，正常對照組表現(xiàn)無異常。

2.2 各組肺組織病理變化比較 正常對照組氣道黏膜完整，支氣管壁及血管壁周圍無炎癥細胞浸潤；模型組氣道壁及氣道平滑肌增厚，支氣管壁及血管壁周圍大量炎癥細胞浸潤；姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組氣道壁及氣道平滑肌增厚不明顯，支氣管壁及血管壁周圍少量炎癥細胞浸潤。

2.3 各組肺組織中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型組肺組織中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達量高(P均<0.05)；與模型組比較，姜黃素高劑量組肺組織中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達量低(P均<0.05)，姜黃素低劑量組與模型組比較、姜黃素低劑量組與姜黃素高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組肺組織中miR-155-5p與磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達量比較

2.4 肺組織中miR-155-5p與磷酸化p38 MAPK蛋白表達的相關(guān)性 肺組織中miR-155-5p表達與磷酸化p38 MAPK蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.870，P<0.01)。

3 討論

哮喘是一種多細胞慢性炎癥性疾病，其關(guān)鍵作用細胞包括嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞以及T淋巴細胞。支氣管哮喘的炎癥進程與黏液高分泌、氣道重塑和氣道高反應相關(guān)。

miRNA是免疫系統(tǒng)中重要調(diào)節(jié)因子，在過敏性氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[5,6]。miR-155在活化的B細胞、T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞中高表達。Calame[7]認為，miR-155是清除病原體和凋亡細胞免疫效應階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，參與B細胞成熟、分化和感染反應期間的抗體類轉(zhuǎn)換。據(jù)報道，糖皮質(zhì)激素通過下調(diào)miR-155表達來減弱脂多糖誘導的炎癥反應及敗血癥。糖皮質(zhì)激素的抗炎作用可通過抑制miR-155的表達來逆轉(zhuǎn)，因此，類固醇抑制miR-155表達可能是免疫反應相關(guān)的新途徑[8]。同時，人類基因Bic/miR-155與哮喘、花粉過敏癥相關(guān)基因均位于染色體21q21區(qū)域，提示哮喘的發(fā)生發(fā)展與miR-155密切相關(guān)[9]。miR-155-5p是miR-155亞型之一，在哮喘小鼠肺組織中表達上調(diào)，抑制miR-155-5p表達有助于改善小鼠哮喘癥狀，降低炎癥因子表達[1]。

MAPK是一種在進化上非常保守的信號分子，在哮喘進展中發(fā)揮重要作用。其成員之一p38 MAPK與炎癥、應激反應的調(diào)控密切相關(guān)。研究表明，p38 MAPK信號通路可介導細胞凋亡、促進各種細胞因子的合成和炎癥細胞的募集等，在哮喘的炎癥反應中起至關(guān)重要的作用[10]。p38 MAPK抑制劑通過抑制糖皮質(zhì)受體的磷酸化，進而促使其核轉(zhuǎn)移，從而恢復糖皮質(zhì)激素的敏感性。相關(guān)研究提示，p38 MAPK抑制劑在糾正難治性哮喘糖皮質(zhì)激素敏感性中發(fā)揮重要作用[11]。

姜黃素是一種來自姜黃的抗氧化多酚，是咖喱香料姜黃的主要成分。研究表明,姜黃素具有化學預防、抗腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移、促腫瘤細胞凋亡、抗血管生成和抗炎作用[12]，對胃腸道、腎臟和心血管無不良反應[13，14]。姜黃素可有效緩解哮喘小鼠模型的氣道阻塞、氣道高反應、炎癥細胞浸潤，降低Th2類細胞因子的異常高表達等。在脂多糖刺激的人全血中，姜黃素抑制由內(nèi)源性或外源性花生四烯酸產(chǎn)生的環(huán)氧合酶2(COX-2)衍生的前列腺素E2(PGE2)形成，抑制COX-2和微粒體PGE2合酶1的表達，從而通過抑制COX-2的表達降低PGE2的形成。姜黃素誘導肺癌細胞A549中has-miR-186-3p表達下調(diào)，增加靶蛋白caspase-10的表達，從而促進肺癌A549細胞凋亡[15]；可通過上調(diào)has-miR-7-5p表達來抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移[16]； has-miR-489-3p與has-miR-486-3p差異表達可能與姜黃素的抗腫瘤作用有關(guān)[17]。

本研究檢測小鼠肺組織中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素干預組哮喘癥狀緩解，同時肺組織中miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白表達較模型組低，提示姜黃素減輕小鼠哮喘癥狀的機制可能與干擾miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK蛋白表達相關(guān)。此外，miR-155-5p和磷酸化p38 MAPK的表達呈正相關(guān)，miR-155-5p可能通過調(diào)控磷酸化p38 MAPK途徑參與哮喘發(fā)病過程。

本研究證實，姜黃素預注射可減輕哮喘小鼠的哮喘癥狀及肺損傷，其機制可能與調(diào)控miR-155-5p、磷酸化p38 MAPK表達有關(guān)。本研究僅選擇兩種劑量的姜黃素進行研究，未對其他劑量姜黃素的效果進行觀察，后期研究將增加其他劑量的分組，進一步完善結(jié)果。