破骨細胞因子對體外培養(yǎng)胎鼠DRG內疼痛相關蛋白表達的影響

苗亞軍，張偉偉

(1山東省立第三醫(yī)院，濟南250013；2山東省腫瘤防治研究院)

多種腫瘤(肺癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌等)可發(fā)生骨轉移。轉移性癌性骨痛(CIBP)約占癌痛的40%。CIBP患者生活質量下降，但目前尚無有效治療方法[1,2]。腫瘤轉移性骨質破壞主要分為成骨性和溶骨性骨質破壞，其中溶骨性破壞時，激活的破骨細胞會導致骨基質釋放大量的生長因子，如轉化生長因子β1(TGF-β1)、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。初級感覺神經元位于背根神經節(jié)(DRG)，這些生長因子對初級感覺神經元的痛覺敏感性是否有影響尚不清楚。2018年1～12月，本研究采用破骨細胞因子體外培養(yǎng)DRG，觀察DRG內疼痛相關蛋白促生激素長神經肽(Gal)、Gal受體1(GalR1)、Gal受體2(GalR2)、P物質(SP)和降鈣素基因相關肽(CGRP)表達的影響，為CIBP的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雌性孕鼠20只，3月齡，體質量250～300 g，購自山東大學實驗動物中心，將孕鼠單獨飼養(yǎng)，常規(guī)飲食。TGF-β1、IGF-Ⅱ、bFGF、PDGF-AA、BMP-5(美國Sigma公司)。Gal(美國Santa cruze公司)，GalR1、GalR2、SP、CGRP(美國Abcam公司)，Goat anti mouse IgG、Goat anti rabit IgG、Donkey anti goat IgG(Bioswamp公司)。

1.2 DRG摘取及培養(yǎng) 取孕15 d的孕鼠，用無菌10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，充分固定后，剪毛，消毒，切開皮膚、腹肌層，充分暴露盆腔。游離兩側子宮系膜，取出子宮放入裝有無菌D-Hank′s緩沖液的培養(yǎng)瓶，沖洗2次，去除子宮及胎盤等附屬物，取出胚胎，置于裝有無菌D-Hank′s緩沖液的培養(yǎng)皿內，將培養(yǎng)皿置于冰盒上備用。將胎鼠置于超凈工作臺內，用顯微鑷除去其胸腹腔臟器，打開椎管，小心取出脊髓，在體視顯微鏡下摘取DRG，并將DRG放入盛有培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板內，每孔放入3～4個神經節(jié)。取材完畢將培養(yǎng)板移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育。培養(yǎng)基成分：92% DMEM/F-12(美國Hyclone公司)、5%FBS(美國Gibco公司)，2% 1×B-27(美國Invitrogen公司)，1%其他添加物(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL、L-谷氨酰胺0.1 mg/mL)。培養(yǎng)孔板內原代培養(yǎng)的DRG生長至第48 h后，棄去原培養(yǎng)液，將DRG隨機分為6組，對照組(含0.1% PBS)、TGF-β1處理組(含10 ng/mL的TGF-β1)、IGF-Ⅱ處理組(含1 μg/mL IGF-Ⅱ)、bFGF處理組(含10 ng/mL的bFGF)、PDGF-AA處理組(含50 ng/mL的PDGF-AA)、BMP-5處理組(含10 μg/mL的BMP-5)，分別加入含破骨細胞相關因子的培養(yǎng)液，作用24 h。

1.3 DRG內疼痛相關蛋白表達檢測 采用Western blotting實驗。經破骨細胞相關因子體外培養(yǎng)24 h，將DRG組織塊取出，置于含少量PBS的EP管中，快速沖洗1次，5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，經裂解后檢測蛋白濃度，每組上樣量30 μg，在SDS-PAGE進行蛋白電泳，在4 ℃條件下轉膜到PVDF上，TBST沖洗3次后用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，然后一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，Gal(1∶1 000)、GalR1(1∶10 000)、GalR2(1∶1 000)、SP(1∶10 000)、CGRP(1∶500)、Goat anti mouse IgG(1∶10 000)、Goat anti rabit IgG(1∶1 000)、Donkey anti goat IgG(1∶1 000)。用ECL顯色全自動化學發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司)進行分析，用Image J軟件分析結果。以待測蛋白與相應內參的光密度比值計算蛋白相對表達量。

1.4 DRG內疼痛相關蛋白mRNA表達檢測 采用熒光實時定量PCR(RT-PCR)技術。經破骨細胞相關因子體外培養(yǎng)24 h，取DRG，吸凈培養(yǎng)液，用PBS快速沖洗1次，將DRG從培養(yǎng)板中夾出，移入不含RNase的EP管中。之后加入TRIzol制成勻漿后提取RNA，用cDNA逆轉錄試劑盒(美國TAKARA)逆轉錄為cDNA，逆轉錄程序42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。用SYBR Green qPCR master mix試劑盒(美國，KAPA Biosystems)進行RT-PCR反應，反應程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39個循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。引物序列(南京金斯瑞生物科技有限公司):Gal上游序列5′-ACCCTGTCAGCCACTCT-3′，下游序列5′-GTCTCCCTTCCTCCACT；GalR1上游序列5′-AACTCCACAAGAAGGCT-3′，下游序列5′-CAAATACCACAACGACC-3′；GalR2上游序列5′-AAACGCAAGGTGACACGGA-3′，下游序列5′-CACAGGAGTTGGCATAGGA-3′；SP上游序列5′-GGCAACGTAGTGGTGATA-3′，下游序列5′-TGGACTGCGTAGGTGAAG-3′；CGRP上游序列5′-AAGTTCTCCCCTTTCCTG-3′，下游序列5′-GTTCCTCCTCCTGCTCCA-3′；β-actin上游序列5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′，下游序列5′-TAGGAGCCAGGGCAGTA-3′。

2 結果

2.1 各組破骨細胞因子對體外培養(yǎng)的DRG內疼痛相關蛋白表達的影響 與對照組比較，各處理組CGRP、Gal、SP蛋白相對表達量高(P均<0.05)，TGF-β1處理組、PDGF-AA處理組GalR1蛋白相對表達量低(P均<0.05)，TGF-β1處理組、bFGF處理組、PDGF-AA處理組GalR2蛋白相對表達量高(P均<0.05)。見表1。

表1 破骨細胞因子對體外培養(yǎng)的DRG內疼痛相關蛋白表達的影響

2.2 破骨細胞因子對體外培養(yǎng)的DRG內疼痛相關蛋白mRNA表達的影響 與對照組比較，各處理組Gal、CGRP mRNA相對表達量高(P均<0.05)，TGF-β1處理組、PDGF-AA處理組GalR1 mRNA相對表達量低(P均<0.05)，TGF-β1處理組、bFGF處理組、PDGF-AA處理組GalR2 mRNA相對表達量高(P均<0.05)，TGF-β1處理組、IGF-Ⅱ處理組、bFGF處理組、PDGF-AA處理組SP mRNA相對表達量高(P均<0.05)。見表2。

3 討論

表2 破骨細胞因子對體外培養(yǎng)的DRG內疼痛相關蛋白mRNA表達的影響

Gal是一種廣泛存在于神經系統的神經肽，主要通過G蛋白偶聯受體GalR1、GalR2發(fā)揮作用。Gal及其受體在多種神經系統創(chuàng)傷性損傷和神經變性中發(fā)揮作用[3,4],具有神經保護作用[5,6]。腫瘤骨轉移導致破骨細胞活化，相關因子大量釋放。本研究結果顯示，破骨細胞相關因子bFGF、TGF-β1、PDGF-AA、BMP-5和IGF-Ⅱ均可促進DRG內Gal的表達。眾所周知，神經元會因周圍神經損傷發(fā)生適應性改變，產生各種功能性蛋白質，以營養(yǎng)神經元促進神經再生。有研究證實，Gal可促進受損坐骨神經再生，并能減輕疼痛[7]。腫瘤骨轉移損傷周圍神經，破骨細胞相關因子可使DRG內Gal表達升高，可能是DRG對損傷的保護性反應，通過升高Gal表達發(fā)揮保護神經元的作用。有研究指出，Gal可影響痛閾。在急性炎癥反應中，Gal在前扣帶回神經元中可起鎮(zhèn)痛作用[8]。在周圍神經損傷后，DRG神經元中的Gal表達增加，而GalR1和GalR2表達則在神經根切斷術后輕微下降[9,10]。研究證實，Gal在痛覺傳導和痛覺過敏中發(fā)揮重要作用[11]。DRG神經元是初級感覺神經元，在持續(xù)外周刺激下，DRG神經元發(fā)生可塑性變化，周圍神經敏感性增加，痛閾降低，產生痛覺過敏和痛覺超敏。破骨細胞相關因子可能通過升高DRG內Gal的表達來調節(jié)DRG神經元的痛覺敏感性，從而降低CIBP。

有研究指出，Gal與GalR1結合可以發(fā)揮抑制疼痛的作用[12～14]，Gal與GalR2結合與細胞的存活和凋亡密切相關[15,16]。在生理情病理況下，Gal及其受體具有很大的可塑性[17,18]。本研究中TGF-β1、PDGF-AA使GalR1表達下調，但上調了Gal和GalR2表達，bFGF促進了Gal和GalR2表達。TGF-β1、bFGF和PDGF-AA是否通過促進Gal表達發(fā)揮對DRG神經元的保護作用和疼痛調節(jié)作用，Gal是通過GalR1還是GalR2發(fā)揮上述作用，尚需進一步研究證實。總之，破骨細胞相關因子TGF-β1、bFGF和PDGF-AA使DRG神經元中Gal、GalR1、GalR2表現出一定可塑性。

SP和CGRP是周圍神經系統兩種重要的肽類神經遞質，這兩種神經肽均與傷害感受性刺激信號的傳導有關，二者在DRG感覺神經元的表達或變化會受到周圍傷害感受性刺激的影響[19,20]。無論在急慢性疼痛中[21]，還是在正常的疼痛或病理性疼痛中[22]，均會導致感覺神經元中SP和CGRP的釋放增加。本研究中破骨細胞相關因子均可促進DRG中CGRP和SP表達，說明破骨細胞相關因子可能在CIBP中發(fā)揮作用。

綜上所述，破骨細胞相關因子bFGF、TGF-β1、PDGF-AA、BMP-5和IGF-Ⅱ可促進DRG內疼痛相關蛋白Gal、SP和CGRP的表達，說明其在CIBP中發(fā)揮重要作用，其具體機制尚需進一步研究。另外本研究中TGF-β1、bFGF和PDGF-AA可使DRG神經元中Gal及GalR表現出一定的可塑性，Gal又具有神經元保護作用，但其具體作用尚需進一步研究證實。