sKlotho對高糖狀態下小鼠成骨細胞增殖與分化的影響

呂秀娟，陳新，王艷，馬小羽

(1沈陽市第四人民醫院，沈陽110031；2中國醫科大學附屬第一醫院)

糖尿病患者存在鈣磷代謝紊亂，膳食不當進一步導致鈣的不足。國內研究顯示，糖尿病患者普遍存在骨密度降低，骨質疏松發病率升高[1,2]。糖尿病性骨質疏松癥是一種繼發性骨質疏松，是糖尿病患者發生的骨骼系統嚴重并發癥。糖尿病患者常見的髖部骨折、腕部骨折及無明顯臨床癥狀的脊椎骨折，絕大多數是由骨質疏松所致[3]。因此探討糖尿病性骨質疏松癥的分子發病機制有重要意義。Klotho是抗衰老基因，Klotho蛋白以兩種形式存在，一種是存在于細胞內的膜型Klotho蛋白(mKlotho蛋白)，另一種是存在于血、尿和腦脊液中的分泌型Klotho蛋白(sKlotho蛋白)。mKlotho蛋白只在表達Klotho的器官中發揮作用，其主要作用是作為纖維生長因子23的輔因子調節機體內鈣磷代謝，從而影響骨代謝。sKlotho在腫瘤、心血管及神經系統中具有抗氧化應激作用，在血管內皮細胞中能抑制P53/P21通路發揮抗衰老作用[4,5]。但對于sKlotho在骨代謝中的作用及機制尚無相關報道。因此，2017年1月～2018年12月，本研究對sKlotho在高糖狀態下成骨細胞的作用進行探討，為研究糖尿病性骨質疏松癥發病機制及防治提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1(中國科學院細胞庫)。改良型α-MEM培養基、1640培養基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(德國PAN公司)，胰蛋白酶(美國GIBCO公司)，DMSO(美國Sigma公司)，sKlotho重組蛋白(美國CLOUD-CLONE CORP)，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物技術研究所)，兔抗小鼠ALP多抗、兔抗小鼠骨鈣素(OC)多抗、兔抗小鼠Runt相關轉錄因子2(Runx2)多抗(美國Biotechnology)細胞培養箱(美國Thermo Forma Company)，低溫離心機(科大創新股份有限公司)，低溫高速離心機(美國Sigma公司)，高溫滅菌器(日本Sanyo)，低溫冰箱(日本Sanyo)，微量加樣器(德國Ependoff)，倒置顯微鏡(日本Olympus)，酶標儀(美國BIOTEK)，電泳儀(美國BIO-RAD),凝膠成像系統(美國MicroChemi)。

1.2 溶液配制 高糖培養基：將葡萄糖溶解于100 mL含10%胎牛血清的改良型α-MEM培養基中，過濾，獲得濃度為35 mmol/L的D-葡萄糖培養基。sKlotho重組蛋白原液：分別將0.01、0.02、0.1、0.2 μg的sKlotho晶體粉末溶解于1 mL雙蒸水中，過濾后，得到相應濃度溶液，于-20 ℃保存。

1.3 細胞培養及分組 取MC3T3-E1細胞放于含10%胎牛血清改良型α-MEM培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，培養至融合度為50%～70%用于后續實驗。將細胞隨機分為高糖組、高糖+0.01 μg/mL sKlotho組、高糖+0.02 μg/mL sKlotho組、高糖+0.1 μg/mL sKlotho組、高糖+0.2 μg/mL sKlotho組，分別加35 mmol/L的葡萄糖與相應濃度sKlotho進行培養，觀察sKlotho對高糖狀態下MC3T3-E1細胞增殖與分化功能的影響。

1.4 MC3T3-E1細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。取各組細胞制成細胞懸液后接種于96孔板(每孔細胞懸液100 mL)，將細胞調整為每孔(6～10)×103個，每孔加入PBS 200 μL，每組設置5個復孔。于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，加入相應藥物干預后，加入CCK-8試劑10 μL/孔，繼續孵育2 h。用酶標儀測定波長450 nm處吸光度值(OD值)，用OD值表示MC3T3-E1細胞增殖能力。

1.5 MC3T3-E1細胞內分化蛋白Runx2、OC、ALP檢測 采用Western blotting實驗。裂解細胞并收集蛋白樣品，用BCA法檢測蛋白質濃度，制備上樣樣本，電泳，轉模后將PVDF膜浸入TBST緩慢洗膜3次，每次10 min。將PVDF膜浸入封閉液(5% BSA)中，封閉2 h。用兔抗小鼠Runx2、OC、ALP、GAPDH孵育PVDF膜，均為1∶500，過夜(4 ℃)，取出PVDF膜，加入TBST緩慢洗膜3次，每次10 min；加入二抗(1∶8 000)孵育2 h，取出PVDF膜，加入TBST緩慢洗膜3次，每次10 min。檢測目的蛋白的表達。

2 結果

2.1 sKlotho對高糖狀態下MC3T3-E1細胞增殖能力的影響 干預72 h后，高糖組、高糖+0.01 μg/mL sKlotho組、高糖+0.02 μg/mL sKlotho組、高糖+0.1 μg/mL sKlotho組、高糖+0.2 μg/mL sKlotho組OD值分別為0.720±0.041、0.824±0.037、0.917±0.025、1.109±0.032、1.204±0.026。隨著sKlotho濃度升高，OD值逐漸升高，高糖+0.2 μg/mL sKlotho組OD值最高，與高糖組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 不同濃度sKlotho對高糖狀態下MC3T3-E1細胞分化能力的影響 隨著sKlotho濃度升高，Runx2蛋白、OC蛋白、ALP蛋白表達水平逐漸升高，高糖+0.2 μg/mL sKlotho組Runx2蛋白、OC蛋白、ALP蛋白表達水平最高，與高糖組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

3 討論

骨質疏松的發生與人體骨量有關。骨量即單位體積內骨組織(鈣、磷等礦物質)、骨基質(如骨膠原、蛋白質、無機鹽等)的含量。骨量越多，骨骼越強壯、堅硬，反之骨骼越脆，越容易斷裂。成骨細胞可促進骨骼形成，而破骨細胞破壞舊骨骼。成骨細胞表面存在胰島素受體，胰島素對骨代謝可能有直接作用，胰島素通過多種途徑間接影響骨骼的重建。胰島素生長因子(IGF)為多肽類生長因子，與成骨細胞與破骨細胞關系密切。IGF可作用于骨原細胞，刺激DNA合成，增加成骨細胞數目；調節成骨細胞的分化功能，增加成骨細胞的活性；調節骨吸收，抑制骨膠原的降解。前期研究發現,糖濃度在35 mmol/L時對MC3T3-E1細胞增殖及分化的抑制作用最強，高糖可顯著抑制成骨細胞的增殖與分化。

表1 不同濃度sKlotho對高糖狀態下MC3T3-E1細胞骨分化蛋白表達的影響

成骨細胞在成骨過程中經歷增殖期、分細胞外基質成熟期及礦化期、凋亡期，在增殖與分化過程中，細胞內一系列基因會參與該過程，調控成骨細胞的增殖與分化。Runx2基因參與成骨細胞分化過程，調控骨鈣素、骨橋蛋白、膠原酶3等基因的轉錄[6,7]；ALP是骨形成必需的酶，ALP基因在成骨細胞分化早期即開始表達，可作為成骨細胞外基質成熟的標志，是成骨細胞表型和分化的標志；礦化期為成骨細胞分化的晚期，此時OC等開始表達，OC是目前惟一只由成骨細胞產生的基質蛋白，是成骨細胞分化和成熟的標志蛋白。本研究發現，高糖干預后，MC3T3-E1細胞內Runx2蛋白、OC蛋白、ALP蛋白表達降低，高糖能夠抑制MC3T3-E1細胞分化功能。

研究發現，糖尿病患者與大鼠中sKlotho表達減少。sKlotho基因變異小鼠壽命明顯縮短，出現早衰現象，如發育遲緩、認知障礙、運動神經元退化、聽力下降及骨量減少，且發生多種鈣磷代謝紊亂。sKlotho是一種細胞因子，可通過調節多條細胞通路發揮作用，如抗OS、抗炎，而敲除sKlotho基因后小鼠發生骨代謝異常[8,9]

目前關于sKlotho的研究多集中于心血管疾病、慢性腎疾病、腫瘤及神經系統疾病等，sKlotho可調節鈣離子通道活性[10]，調節胰島素/IGF-1信號通路[11]，抗氧化應激[12]，調節Wnt信號通路[13]及炎癥細胞因子[14]，而在骨代謝中的研究較少。因此，本研究探討高糖狀態下sKlotho對小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖與分化的影響。為觀察高糖狀態下MC3T3-E1細胞增殖及分化的變化，本研究設置了0.01、0.02、0.1、0.2 μg/mL四個濃度的sKlotho，發現隨著sKlotho濃度升高，其對小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖與分化的改善作用越強，sKlotho濃度為0.2 μg/mL時作用最強。說明一定濃度的sKlotho對高糖狀態下MC3T3-E1細胞的增殖能力、分化能力有改善作用。

綜上所述，sKlotho對高糖狀態下MC3T3-E1細胞的增殖與分化有改善作用，為糖尿病性骨質疏松癥的臨床診治提供了新靶點。但本研究也有不足之處，未進一步探討sKlotho的作用機制，僅探討4組濃度sKlotho的干預效果，將來可擴大濃度范圍并進一步探討其作用機制。