VAP患者CRE醫院感染分子流行病學特征及影響因素

張昭勇，高波，李顯東，張吉才

(十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬醫院，湖北十堰442000)

腸桿菌科細菌是醫院感染最常見的病原菌，其中碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(CRE)因對多種臨床常用抗菌藥物有很高的耐藥性而越來越受到關注。有研究發現，CRE的感染與患者發病率、病死率有關，特別是在危重患者中尤為明顯[1]。臨床多用大劑量美羅培南聯合多黏菌素治療CRE引起的呼吸機相關性肺炎(VAP)，但隨著耐多黏菌素菌株的出現，使CRE感染的臨床治療越來越困難[2]。近年來在全世界范圍內均出現對碳青霉烯類抗菌藥物敏感性下降或耐藥的菌株。目前，國內對VAP患者CRE感染分子流行病學特征、醫院感染危險因素的研究較少。本研究對此作了探討，為感染患者的防護和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2018年6月本院收治的VAP患者58例，均為非重復CRE感染患者(CRE感染組)。另外按照1∶2比例選取同期(15 d內)116例VAP患者作為對照組，均為非CRE腸桿菌科細菌感染的患者，其中肺炎克雷伯菌62例、大腸埃希菌30例、陰溝腸桿菌17例、產酸克雷伯菌5例及枸櫞酸桿菌2例。VAP診斷標準：使用呼吸機48 h后發生肺部感染，并結合臨床表現、影像學檢查、病原學檢查確診。患者對本研究均知情同意。

1.2 細菌鑒定及藥物敏感性檢測 患者早上用溫開水漱口清除口腔內雜菌，然后用力從氣管深部咳出痰液，吐入廣口帶蓋的無菌容器內送檢。按全國臨床檢驗操作規程進行菌株分離培養，使用DL-96細菌測定系統進行細菌鑒定。按照2015年美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦的MIC法進行藥物敏感試驗和結果判斷。

1.3 碳青霉烯酶表型篩查 美羅培南或亞胺培南MIC≥2 mg/L為CRE感染的判定標準。用改良碳青霉烯滅活實驗(mCIM)和乙二胺四乙酸碳碳青霉烯類失活法(eCIM)進行檢測。mCIM實驗操作步驟：取接種環待測細菌1 μL置于2 mL TSB肉湯中；振蕩混勻后每管放入一張含10 μg美羅培南的無菌紙片，于35 ℃孵育4 h。用生理鹽水制備0.5 Mc的大腸埃希菌ATCC 25922懸液；將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出，擠去紙片上多余水分，然后將紙片貼于已涂有大腸埃希菌的MHA平板上，于35 ℃大氣環境孵育24 h量取抑菌圈直徑。eCIM實驗操作步驟：取第2支含2 mL TSB的肉湯管，加入20 μL EDTA溶液,其余步驟同mCIM實驗。mCIM與eCIM實驗同步進行。mCIM和eCIM實驗管中的美羅培南紙片貼于同一塊已涂有大腸埃希菌的MHA平板上。mCIM結果判斷標準：抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm但抑菌圈內有散在菌落為陽性；抑菌圈直徑≥19 mm為陰性；抑菌圈直徑為16～18 mm，或直徑≥19 mm但抑菌圈內有散在菌落為結果無法判斷。eCIM陽性結果判斷標準：與mCIM結果相比，美羅培南抑菌圈直徑≥5 mm。

1.4 CRE耐藥基因檢測 采用PCR法。加熱裂解法提取細菌DNA，PCR擴增細菌耐藥基因。引物(由武漢安基生物科技有限公司合成)序列見表1。PCR擴增體系：ddH2O 20 μL，引物2 μL，2×PCR Master 25 μL，DNA 1 μL。反應條件：94 ℃變性5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環，72 ℃延伸5 min，2%瓊脂糖凝膠電泳分離產物。

表1 耐藥基因引物

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗；對CRE感染影響因素進行單因素分析，篩選可能的危險因素，以可能的危險因素作為自變量，進行多因素非條件Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRE感染病原菌分布 從483例VAP患者中檢出58株非重復CRE菌，其中肺炎克雷伯菌最為常見26株(44.8%)，其次是大腸埃希菌15株(25.8%)、陰溝腸桿菌8株(13.8%)、產酸克雷伯菌7株(12.1%)、弗氏枸櫞酸桿菌1株(1.7%)、黏質沙雷菌1株(1.7%)。

2.2 CRE感染患者科室分布 58例醫院感染患者分布于ICU 18例(31.0%)，其中感染肺炎克雷伯菌9例、大腸埃希菌5例、產酸克雷伯菌3例、弗氏檸檬酸桿菌1例；神經外科10例(17.2%)，其中感染肺炎克雷伯菌2例、大腸埃希菌3例、陰溝腸桿菌3例、產酸克雷伯菌3例；呼吸內科16例(27.6%)，其中感染肺炎克雷伯菌6例、大腸埃希菌3例、陰溝腸桿菌4例、產酸克雷伯菌2例、黏質沙雷菌1例；泌尿外科2例(3.4%)，均為大腸埃希菌感染；骨科1例(1.7%)，為肺炎克雷伯菌感染；老年醫學科4例(6.9%)，均為肺炎克雷伯菌感染；兒科3例，其中感染肺炎克雷伯菌2例、大腸埃希菌3例；腫瘤科2例，分別為肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌感染。

2.3 CRE的藥物敏感性 測試菌對頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢他啶、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢西丁、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸和環丙沙星均100%耐藥。敏感的抗生素藥敏結果見表2。

表2 CRE的藥物敏感性

2.4 碳青霉烯酶表型 58株CRE僅mCIM陽性23株，mCIM與eCIM均陽性30株，mCIM與eCIM均陰性3株，無法判斷2株。

2.5 CRE相關耐藥基因分布 肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌及產酸克雷伯菌均檢測出不同種類的耐藥基因，弗氏檸檬酸桿菌、黏質沙雷氏菌未檢測出耐藥基因。見表2。

2.6 CRE感染的危險因素

表2 CRE相關耐藥基因分布(%)

2.6.1 單因素分析結果 兩組入住ICU>7 d、用β-內酰胺酶抑制劑抗生素、碳青霉烯類抗生素、聯合用藥、神經損傷比例比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表3。CRE感染組、對照組住院時間分別為(36±6.6)、(15±5.2)d，病死率37.9%(22/58)、11.2%(13/116)。與對照組比較，CRE感染組住院時間長(P<0.05)、病死率高(P<0.05)。

2.6.2 多因素分析結果 將兩組單因素分析差異有統計學意義的5個因素納入Logistic回歸分析，結果顯示入住ICU>7 d(OR=3.431， 95%CI1.251～4.152)、含β-內酰胺酶抑制劑抗生素使用(OR=3.018，95%CI1.102～5.394)、碳青霉烯類抗生素使用(OR=5.232，95%CI2.579～7.561)是VAP患者CRE醫院感染的獨立危險因素。

3 討論

CRE感染率近年來呈不斷升高趨勢，越來越引起臨床重視[3]，尤其是質粒介導產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌酶的碳青霉烯耐藥菌株在世界范圍內廣泛流行。CRE作為醫院感染的重要病原菌，可明顯增加患者病死率。對CRE的分子流行病學特征及感染危險因素進行探討，并評估CRE對臨床常用藥物的敏感性，可為臨床抗感染治療方法選擇和CRE流行播散控制提供依據。

表3 CRE感染危險因素單因素分析(例)

本研究分離的非重復CRE菌58株，其中肺炎克雷伯菌最為常見，其次是大腸埃希菌、陰溝腸桿菌，這與我國CRE的流行情況一致[4]。ICU是CRE感染最常見的科室，其次是呼吸內科、神經外科。原因可能為以上科室患者抗生素使用量大、侵入性操作多、患者免疫力低。因此，對上述重點科室的感染控制可能有利于防止CRE的播散。

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥的機制比較復雜。目前研究表明，CRE最主要的耐藥機制是產碳青霉烯酶。mCIM和eCIM是CLSI推薦的檢測碳青霉烯酶表型的篩查方法。mCIM用于檢測腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶，而eCIM與mCIM聯合用來區分產金屬酶(Ambler B類)和產絲氨酸碳青霉烯酶(Ambler A類)的腸桿菌科細菌。本研究結果顯示，產Ambler B類金屬酶和Ambler A類絲氨酸碳青霉烯酶是CRE的主要耐藥機制，這與董愛英等[5]報道的以絲氨酸碳青霉烯酶為主有所差異，可能是不同地區耐藥基因流行有差異。

本研究中58株CRE均表現為多重耐藥，其中7株表現為泛耐藥，未發現全耐藥菌株。菌株對目前臨床常用抗菌藥物如頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢他啶、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢西丁、氨芐西林/舒巴坦均100%耐藥。多黏菌素B是研究中針對CRE最為敏感的抗生素(敏感率100%)，因此聯合用藥治療CRE感染推薦多黏菌素B作為首選藥物之一。米諾環素(敏感率55.2%)、阿米卡星(敏感率48.3%)和復方新諾明(敏感率43.1%)在體外藥物敏感試驗中對CRE也具有較高的敏感性。阿維巴坦作為新一代β-內酰胺酶抑制劑對A類絲氨酸碳青霉烯酶具有抑制作用，但對B類金屬酶缺乏活性[6]。雖然頭孢他啶/阿維巴坦治療CRE感染有良好的效果，但是本研究中金屬酶作為CRE株最主要的耐藥酶限制了該類藥物的使用。

本研究針對CRE的分子檢測及遺傳特性分析發現，碳青霉烯酶基因和ESBLs基因是最主要的耐藥機制。52株細菌碳青霉烯酶基因陽性，其中30株NDM-1基因陽性，24株KPC/KPC-2基因陽性，2株IMP基因陽性，有4株肺炎克雷伯菌同時檢測出NDM-1和KPC耐藥基因，而2株IMP基因陽性菌均為產酸克雷伯。不同耐藥基因在各個菌種間分布存在差異，在肺炎克雷伯菌中最主要的是KPC-2，而在大腸埃希菌中最主要的是NDM-1。值得注意的是以往國內研究報道中NDM-1耐藥基因在肺炎克雷伯菌中較為少見[7]，但本研究發現34.6% 的菌株攜帶NDM-1耐藥基因，并且有4株肺炎克雷伯同時檢測出NDM和KPC耐藥基因，這可能與地方流行有關。提示應該關注NDM耐藥基因在本地區的流行播散。IMP基因在有些地區報道較為普遍，但在中國較為少見，僅在產酸克雷伯中發現2株[8]。OXA-48型耐藥基因在歐洲較常見，在本研究中尚未發現該類耐藥基因。在檢測到的ESBL耐藥基因中，CTX-M型特別是CTX-M-9型最為常見，其次是TEM型和SHV型超廣譜 β-內酰胺酶基因，這與中國ESBL耐藥基因的流行基本一致[9]。

抗生素的選擇壓力是細菌產生多重耐藥性的一個重要因素。有研究表明，碳青霉烯類抗生素對腸桿菌科細菌的選擇壓力有利于篩選出產碳青霉烯酶株，從而導致CRE株的大量產生[10]。β-內酰胺酶抑制劑廣譜抗生素使用易產生CRE的原因包括抗生素的篩選作用和β-內酰胺酶抑制劑的誘導作用。有研究顯示，聯合使用抗生素是CRE感染的危險因素[11]，但在本研究中并非CRE感染的危險因素。這表明導致CRE感染較高的主要因素可能是使用了含β-內酰胺酶抑制劑廣譜抗生素和碳青霉烯類抗生素，而聯合用藥本身只是其混雜因素。ICU入住>7 d是感染CRE的另一個重要危險因素，其原因是ICU患者住院時間越長，發生院內感染的概率就越高；并且抗生素使用頻繁，侵入性操作多，導致接觸耐藥菌的機會就多，病原菌耐藥情況就更加嚴重。所以應根據抗菌藥物敏感試驗選擇抗生素，從而減少CRE耐藥菌株的產生。本研究還發現，CRE感染組病死率高于對照組，平均住院時間較對照組長。

總之，VAP患者醫院感染CRE株耐藥性強，患者病死率高。入住ICU>7 d及使用含β-內酰胺酶抑制劑抗生素、碳青霉烯類抗生素的VAP患者易感染CRE。因此，加強臨床抗菌藥物的管理和應用，隔離防護ICU患者、規范臨床操作是控制和預防CRE播散的有效方法。