活動期全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患兒外周血Th17/Treg的變化及意義

孫廣超，曾華松

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣州510180)

幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)是兒童常見的以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎為主的自身免疫性疾病，發(fā)病原因可能涉及遺傳、環(huán)境、免疫紊亂等多種因素[1,2]。全身型JIA(SJIA)以發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)炎等全身癥狀為主要表現(xiàn)，發(fā)病率約占JIA的10%，如診治不及時，可致患兒殘疾[3]。SJIA發(fā)病原因和機制尚無統(tǒng)一定論，目前臨床確診主要依靠臨床表現(xiàn)和實驗室檢查。但SJIA臨床表現(xiàn)特異性差，其他JIA亞型也可表現(xiàn)為與SJIA相似的臨床癥狀體征；實驗室指標如抗可溶性核抗原、抗核抗體、類風(fēng)濕因子等用于診斷SJIA的靈敏度和特異度較差[4]。尋找其他有效、方便的方法輔助診斷SJIA已成為研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，初始輔助性T細胞(Th細胞)在細胞因子介導(dǎo)下可分化為Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)等亞群，并發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。Th17細胞促進炎癥反應(yīng)發(fā)生，并與自身免疫性疾病、惡性腫瘤發(fā)病密切相關(guān)；Treg細胞主要有免疫負調(diào)控并抑制自身免疫性疾病發(fā)生、維持自身免疫耐受等功能[5,6]。正常情況下，Th17/Treg處于動態(tài)平衡。研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg失衡參與了JIA發(fā)病過程[7]。但在SJIA發(fā)病過程中Th17/Treg的作用，目前研究相對較少。本研究探討SJIA活動期患兒外周血Th17/Treg的變化，探討其在SJIA發(fā)病過程中的作用及其與疾病活動性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年12月～2018年12月本院門診和住院治療的SJIA活動期患兒93例，男54例，女39例；年齡4～16(8.93±5.57)歲；病程0.3～3.6(1.82±0.95)年；28處關(guān)節(jié)疾病活動度(DAS28)評分2.9～11.2(5.79±3.22)分。根據(jù)DAS28評分[8]將患者分為低度活動組(n=39，2.6分5.5分)。納入標準：符合國際風(fēng)濕病學(xué)聯(lián)盟兒科專家組制訂的關(guān)于SJIA的診斷標準[9]；符合SJIA活動期診斷，即有關(guān)節(jié)癥狀如關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等，同時包含全身紅斑、關(guān)節(jié)觸痛、發(fā)熱、關(guān)節(jié)活動受限中的至少1項，C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)升高且DAS28>2.6分；符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求；患兒家屬簽署知情同意書。排除標準：心、肝、腎功能障礙；血液系統(tǒng)疾病；其他可能影響本研究結(jié)果的自身免疫性疾病；急慢性感染；惡性腫瘤。同期隨機選取50例SJIA緩解期患兒(緩解組)、50例體檢健康兒童(健康對照組)為對照。緩解組男29例，女21例；年齡4～15(8.27±6.04)歲；病程0.5～3.3(1.76±1.02)年；納入標準：符合SJIA緩解期診斷標準，即患兒治療6個月后臨床癥狀緩解，CRP、ESR恢復(fù)正常，DAS28評分<2.6分，2個月內(nèi)無活動期相關(guān)臨床癥狀。健康對照組男31例，女19例；年齡5～16(8.56±5.92)歲。各活動組、緩解組性別、年齡、病程具有可比性，各活動組、緩解組、健康對照組性別、年齡具有可比性。

1.2 Th17細胞、Treg細胞比例及Th17/Treg檢測 采集活動期患兒入院次日、緩解組入院當(dāng)日與健康對照組體檢時清晨空腹肘靜脈血5 mL，用肝素鈉100 μL進行抗凝，并加入鼠抗人PerCP-抗CD3、FITC-抗CD4、PE-抗CD8抗體20 μL，4 ℃環(huán)境下孵育30 min，加入NH4Cl溶血劑4 mL進行溶血，以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次后進行檢測。將經(jīng)過肝素鈉抗凝后的全血與RPMI1640培養(yǎng)液混勻，比例為1∶1，在CO2培養(yǎng)箱中，室溫環(huán)境下培養(yǎng)4 h，備好細胞等分測定管以及同型對照管，加入PerCP-抗CD3、FITC-抗CD8抗體，在4 ℃環(huán)境下避光孵育30 min，PBS洗滌2次，用固定液在37 ℃環(huán)境下避光反應(yīng)15 min，棄上清液，以PBS洗滌2次，加入破膜劑、FE標記抗人白細胞介素17A(IL-17A)單抗，細胞內(nèi)染色，用PBS洗滌2次后進行檢測。在肝素鈉抗凝血中加入經(jīng)PerCP標記的CD4單克隆抗體、經(jīng)FITC標記的CD25，并將其作為測定管，同時設(shè)立同型對照管。采用流式細胞術(shù)檢測Th17細胞、Treg細胞占CD4+T細胞的比例，計算Th17/Treg值。FACScan流式細胞儀購于美國Becton-Dickinson公司。

1.3 細胞因子檢測 參照1.2抽取各組空腹肘靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心5 min，離心半徑為12 cm，留取血清置于-20 ℃環(huán)境下保存，留待檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中白細胞介素6(IL-6)、IL-17、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)水平。IL-6檢測試劑盒購自比利時Innogentics公司，IL-10、IL-17、TGF-β1檢測試劑盒購自美國R&D Systems公司。嚴格按照試劑盒相關(guān)說明進行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血Th17細胞、Treg細胞比例及Th17/Treg值比較 各組外周血Th17細胞、Treg細胞比例及Th17/Treg值比較見表1。

表1 各組外周血Th17細胞、Treg細胞比例及Th17/Treg值比較

注：與緩解組、健康對照組比較，*P<0.05；與低度活動組比較，#P<0.05；與中度活動組比較，▲P<0.05。

2.2 各組血清細胞因子水平比較 各組血清IL-6、IL-17、TGF-β1、IL-10水平比較見表2。

表2 各組血清細胞因子水平比較

注：與緩解組、健康對照組比較，*P<0.05；與低度活動組比較，#P<0.05；與中度活動組比較，▲P<0.05。

2.3 SJIA活動期患兒血清細胞因子水平的相關(guān)性 經(jīng)Pearson積矩相關(guān)分析結(jié)果顯示，SJIA活動期患兒血清IL-6、IL-17水平與IL-10水平呈負相關(guān)(r分別為-0.537、-0.612，P均<0.05)，與TGF-β1水平呈正相關(guān)(r分別為0.416、0.509，P均<0.05)。

2.4 SJIA活動期患兒血清細胞因子水平與DAS28評分的相關(guān)性 經(jīng)Pearson積矩相關(guān)分析結(jié)果顯示，SJIA活動期患兒血清IL-6、IL-17、TGF-β1水平與DAS28評分呈正相關(guān)(r分別為0.692、0.725、0.607，P均<0.05)，IL-10水平與DAS28評分呈負相關(guān)(r=-0.624，P<0.05)。

3 討論

SJIA病情復(fù)雜，常伴有不同程度急性炎癥反應(yīng)，診治不及時可伴發(fā)巨噬細胞活化綜合征，并損傷全身多個器官，病死率較高，預(yù)后較差。隨著生物制劑在臨床的廣泛使用，SJIA的病死率雖有下降，但仍有部分患兒發(fā)生慢性疼痛及殘疾[10,11]。進一步研究SJIA發(fā)病原因及機制是臨床熱點，也對輔助臨床診斷并制訂針對性治療方案具有重要意義。Th17細胞、Treg細胞是由初始T細胞分化而來，兩者具有相反的分化方向，發(fā)揮相反的功能。正常情況下，兩者處于動態(tài)平衡以維持機體的免疫穩(wěn)定[12]。Th17細胞主要發(fā)揮促炎作用，IL-17A還可與腫瘤壞死因子α(TNF-α)、TGF-β等炎性細胞因子結(jié)合，共同誘導(dǎo)并促進其他具有炎性活性的基因表達，以發(fā)揮促炎作用，使炎性細胞浸潤并損傷組織。Treg細胞主要在自身反應(yīng)性T細胞的免疫抑制過程中發(fā)揮重要作用，通過限制免疫應(yīng)答的效力和強度來減輕免疫反應(yīng)所致的組織損傷。譚艷芳等[13]研究表明，Th17、Treg細胞及Th17/Treg失衡介導(dǎo)了巨細胞病毒感染發(fā)病的免疫機制，并且IL-6、IL-10、IL-17等相關(guān)細胞因子與病毒的潛伏-激活狀態(tài)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg失衡參與了慢性阻塞性肺疾病發(fā)病、風(fēng)濕免疫性疾病、強直性脊柱炎發(fā)病過程[14～16]。JIA發(fā)病與Th17/Treg失衡密切相關(guān)，同時相關(guān)細胞因子還介導(dǎo)了JIA患兒的關(guān)節(jié)損害[17]。免疫反應(yīng)失調(diào)和免疫復(fù)合物沉積在SJIA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，SJIA活動期患兒Th17細胞比例、Th17/Treg值升高，且明顯高于SJIA緩解期患兒、健康兒童；Treg細胞比例明顯下降。提示Th17/Treg失衡與SJIA發(fā)病密切相關(guān)，并證實其介導(dǎo)了SJIA免疫機制，與有關(guān)研究[11]結(jié)果相似。隨著SJIA活動度增加，患兒Th17細胞比例、Th17/Treg值均逐漸升高，Treg細胞比例逐漸降低。可見Th17/Treg是反映SJIA疾病活動的重要標志物，早期對其進行檢測可評估病情活動度，從而為臨床診斷和治療提供指導(dǎo)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，SJIA活動期患兒IL-6、IL-17、TGF-β1水平高于緩解組與健康對照組，IL-10水平低于緩解組與健康對照組。IL-6、IL-17是由Th17細胞合成并分泌的細胞因子，其中IL-6作為促炎因子可使機體T細胞激活而加劇炎性反應(yīng)，導(dǎo)致機體出現(xiàn)炎癥損傷；IL-17是強致炎因子，不僅可以激活T細胞和刺激內(nèi)皮細胞、上皮細胞以及成纖維細胞等,并產(chǎn)生IL-6、IL-8等細胞因子而致炎癥發(fā)生，同時還可促進前炎性細胞因子的釋放以加劇炎癥反應(yīng)[18]。活動度越強的患兒，IL-6、IL-17水平越高，提示Th-17分泌的炎性細胞因子參與了SJIA發(fā)展過程。TGF-β1主要由Treg細胞分泌，本研究發(fā)現(xiàn)患兒活動度越強，其水平越高。可能是因為SJIA活動期炎癥反應(yīng)加重，可促進TGF-β1的水平升高；同時，TGF-β1又可促進Th17分化，導(dǎo)致Th17/Treg失衡，如此反復(fù)循環(huán)。IL-10是由Treg細胞分泌，具有抗炎功能，并抑制促炎細胞因子的合成。本研究結(jié)果顯示，SJIA患兒外周血中IL-10水平降低，疾病活動度越強，其水平越低。這與Treg細胞比例變化一致。通過調(diào)控IL-10水平可能抑制Th17水平，這為臨床治療SJIA提供了思路。上述結(jié)果提示炎性細胞因子參與了SJIA發(fā)生發(fā)展過程，早期對其進行檢測對判斷疾病活動度及制訂診療方案具有重要價值。

另外，IL-6、TGF-β1在Th17細胞與Treg細胞連接中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)TGF-β1單獨刺激時可促進Foxp3+Treg細胞的分化，當(dāng)其與IL-6共同作用時，可促進RoRγt基因的表達，并進一步促進Th17細胞的分化。本研究中，SJIA活動期患兒Th17細胞分泌的促炎細胞因子IL-6、IL-17水平與Treg細胞分泌的抗炎因子水平呈負相關(guān)，與TGF-β1呈正相關(guān)。提示細胞因子可能是導(dǎo)致Th17/Treg失衡的關(guān)鍵，也是引起免疫機制紊亂的始動因素，早期檢測細胞因子水平可反映Th17/Treg的穩(wěn)定情況。此外，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SJIA活動期患兒細胞因子IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β1與DAS28分值呈不同程度相關(guān)性，說明早期檢測Th17/Treg相關(guān)細胞因子，可作為臨床評估病情活動度的重要指標。

綜上所述，Th17細胞比例上升、Treg細胞比例下調(diào)、Th17/Treg失衡參與了SJIA的發(fā)生發(fā)展過程。Th17、Treg相關(guān)細胞因子參與了SJIA活動期的免疫機制，有望作為臨床評估患兒病情的重要標記物。本研究樣本量較小且為回顧性研究，建議開展大樣本隊列研究進一步探討Th17/Treg在活動期SJIA發(fā)病過程中的作用。