癡呆患者血清miR-9、miR-34c表達變化及意義

潘曉峰，劉文娟

(1丹東市第一醫院，遼寧丹東118000；2哈爾濱醫科大學附屬第二醫院)

癡呆是臨床常見的進行性中樞神經系統退行性疾病，臨床主要表現為漸進性記憶衰退、認知功能障礙、語言障礙等[1,2]，該病多發于65歲以上老年人。我國癡呆患者居全球首位，高達950萬，據估計，到2050年將增至3 000萬[3]。癡呆發病機制尚不明確，其早期診斷缺乏特異性生物標志物。大部分患者確診時已進展至臨床癥狀明顯階段，神經系統損傷明顯，預后較差。尋找靈敏度、特異度高的標志物輔助臨床早期診斷并評估患者病情嚴重程度，對制訂針對性治療方案，改善病情有重要意義。微小RNA(miRNA)主要存在于真核生物中，是長度為18～25個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，通過完全或不完全方式與其靶mRNA3′UTR配對，從而降解mRNA或抑制蛋白質翻譯[4]。miRNA不僅介導了細胞增殖、分化以及凋亡等生理活動，還參與了惡性腫瘤病理過程的發生發展[5]。miRNA與精神分裂癥、帕金森病等神經系統疾病密切相關[6,7]。研究顯示，miR-9、miR-34c參與了惡性腫瘤的生物學進程[8,9]，但二者在癡呆發病中的作用，目前研究較少。本研究觀察癡呆患者血清miR-9、miR-34c表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月～2019年3月丹東市第一醫院神經內科收治的135例癡呆患者，納入標準：①符合美國國家衰老研究所與阿爾茨海默病學會對癡呆的診斷標準[10]；②臨床癡呆分級量表(CDR)評分[11]≥1分；③簡易精神狀態檢查量表(MMSE)[12]評分<24分；④符合醫學倫理學要求；⑤患者家屬知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：①心功能不全；②肝腎功能障礙；③患精神分裂癥、抑郁癥等精神類疾病；④伴高血壓、糖尿病等慢性疾病；⑤患急、慢性免疫性疾病及炎癥反應性疾病；⑥有腦梗死、腦出血等腦部疾病史；⑦惡性腫瘤；⑧患有其他可能影響本研究結果的疾病。根據CDR評分將其分為輕度癡呆組(n=59，CDR評分=1分)、中度癡呆組(n=45，CDR評分=2分)、重度癡呆組(n=31，CDR評分=3分)。輕度癡呆組男32例、女27例，年齡(72.83±6.14)歲，BMI(22.56±2.37)kg/m2；中度癡呆組男28例、女17例，年齡(71.05±6.92)歲，BMI(21.89±3.06)kg/m2；重度癡呆組男19例、女12例，年齡(73.39±7.11)歲，BMI(23.02±2.67)kg/m2。并于同期隨機選取60例健康體檢者為對照組，排除癡呆、高血壓、糖尿病等慢性疾病；心功能不全、肝腎功能障礙、急慢性免疫系統疾病及炎癥性疾病。其中男37例、女23例，年齡(70.55±6.34)歲，BMI(23.15±2.30)kg/m2。各組性別分布、年齡、BMI比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

1.2 血脂、血清脂聯素(ADP)及血清同型半胱氨酸(Hcy)水平檢測 采集癡呆患者入院次日及對照組體檢時清晨空腹肘靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，離心半徑12 cm，留取上清液置于-80 ℃環境下保存，留待檢測。采用羅氏P800全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，試劑盒由北京九強生物科技有限公司提供；采用雙抗體夾心法檢測血清ADP，試劑盒由武漢博士德公司提供；采用酶聯免疫吸附法檢測血清Hcy，試劑盒由上海東方順宇生物科技有限公司提供。上述檢測過程嚴格按照試劑盒相關說明進行操作。

1.3 認知功能評價 采用MMSE評分。內容主要包括定向力(10分)、注意力和計算力(5分)、記憶力(3分)、語言表達能力(9分)、回憶力(3分)，滿分30分，分數與認知功能呈正比。

1.4 血清miR-9、miR-34表達檢測 采用實時熒光定量PCR法(RT-qPCR)。用RNA提取試劑盒(德國凱杰公司)提取血清總RNA，用ARLC&2100B儀(美國Agilent公司)分析樣本的RNA濃度以及純度，將其于低溫環境下保存。按照miScript Ⅱ RT Kit說明書進行操作，將純化后的cDNA溶入20 μL RNase-Free dd H2O中，反應體系：RNA 500 ng，5×miScript RT Buffer 1 μL，miScript Reverse Transcriptase Mix 1 μL，最后加入H2O使其體積達20 μL，混勻后孵育進行反轉錄。將適量cDNA加入去RNase的PCR管中，內參基因為U6，其上游引物序列：5′-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGC-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCT-3′，長度為265 kb；miR-9上游引物序列：5′-CGGAGATCTTTTCTCTCTTC-3′，下游引物序列：5′-CAAGAATTCGCCCGAACCAG-3′，長度為249 kb；miR-34c上游引物序列：5′-ACGCGTCGACATGTCTCAGT-3′，下游引物序列：5′-CGGGATCCTCATTCAGCAGA-3′，長度為256 kb。引物序列由Invitrogen公司合成。cRT-qPCR反應體系：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，10×miScript Primer Assay引物2 μL，模板cDNA 2 μL，無酶RNA H2O 4 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，循環40次。用2-△△CT法計算miR-9、miR-34c相對表達量。實驗重復3次取平均值。

2 結果

2.1 各組血脂、ADP、Hcy水平及MMSE評分比較 各組HDL-C、LDL-C、ADP、Hcy、MMSE評分比較差異有統計學意義(P均<0.05)，各組TC、TG比較差異無統計學意義(P均>0.05)，各指標組間兩兩比較見表1。

表1 各組血脂、ADP、Hcy水平及MMSE評分比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕度癡呆組比較，#P<0.05；與中度癡呆組比較，△P<0.05。

2.2 各組血清miR-9、miR-34c表達比較 各組血清miR-9、miR-34c表達比較差異有統計學意義(P均<0.05)，組間血清miR-9、miR-34c表達兩兩比較見表2。

表2 各組血清miR-9、miR-34c表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕度癡呆組，#P<0.05；與中度癡呆組，△P<0.05。

2.3 癡呆患者血清miR-9、miR-34c表達與HDL-C、LDL-C、ADP、Hcy、MMSE評分的相關性 Pearson積矩相關分析結果顯示，癡呆患者血清miR-9與HDL-C、ADP、MMSE評分呈正相關(P均<0.05)，與LDL-C、Hcy呈負相關(P均<0.05)；血清miR-34c與HDL-C、ADP、MMSE評分呈負相關(P均<0.05)，與LDL-C、Hcy呈正相關(P均<0.05)。見表3。

2.4 血清miR-9、miR-34c對癡呆的診斷價值 繪制ROC曲線，結果顯示，血清miR-9診斷癡呆的ROC曲線下面積(AUC)為0.811(95%CI：0.720～0.902)，約登指數為0.81，截斷值為0.82，靈敏度、特異度分別為0.82、0.79，準確性為0.83；血清miR-34c診斷癡呆的AUC為0.838(95%CI：0.751～0.925)，約登指數為0.85，截斷值為1.01，靈敏度、特異度分別為0.85、0.83，準確性為0.89；血清miR-9聯合miR-34c診斷癡呆的AUC為0.923(95%CI：0.872～0.975)，靈敏度、特異度分別為0.89、0.87，準確性為0.90。見圖1。

表3 癡呆患者血清miR-9、miR-34c表達與HDL-C、LDL-C、ADP、Hcy、MMSE評分的相關性

3 討論

隨著人口老齡化，我國癡呆患病人數逐年升高，給家庭和社會帶來極大經濟負擔，早期診治是控制病情進展、改善患者預后的重要措施。癡呆發病機制復雜，涉及年齡、遺傳、神經傳遞異常、炎癥反應等多種因素[13]，給早期診治帶來巨大挑戰，尋找血清學標志物輔助臨床診斷成為研究熱點。隨著分子生物學研究的深入，研究發現，癡呆患者大腦組織和外周血中存在差異性表達的miRNA，提示其可能通過調控靶基因而介導精神分裂癥的發病過程[14]。miRNA是存在于真核生物中的內源性小分子單鏈RNA，不編碼蛋白質，在后轉錄水平可與靶mRNA的3′端非翻譯區以堿基互補配對的方式結合，使mRNA的翻譯受到抑制或使其降解，進而調控靶基因的表達[15]。miRNA不僅介導了細胞增殖、分化、生長及脂肪代謝、器官形成等生理過程，而且還與多種疾病密切相關，如作為促癌或抑癌基因參與惡性腫瘤的發生發展過程。miRNA能在組織中特異性表達且穩定性好，并且是非侵入性的血清學標志物，簡單易得，成本較低，現已被推薦作為早期診斷惡性腫瘤的重要標志物[16]。

圖1 血清miR-9、miR-34c診斷癡呆的ROC曲線

miR-9包括前體miR-9和成熟的miR-9，成熟的miR-9可抑制鋅指蛋白521的表達而使骨髓間充質細胞分化為神經細胞，同時介導突觸孔蛋白、突觸小泡磷酸酶1等基因的表達,而對神經元間突觸傳遞遞質功能造成影響，并進一步影響神經元的活性。淀粉樣蛋白前體(APP)以及淀粉樣前體蛋白β位點裂解酶1(BACE1)通過剪切作用可形成β-淀粉樣蛋白(Aβ)，而Aβ表達異常介導了神經元變性過程。研究顯示[17]，miR-9在阿爾茨海默病患者大腦海馬區、顳葉區等部位異常表達，通過調控APP、BACE1等的功能而對Aβ的表達產生影響，進而介導神經退行性變過程。miR-34是廣泛表達于人類細胞的miRNA，已有研究證實，其參與了多種惡性腫瘤的生物學進程。miR-34包括miR-34a、miR-34b、miR-34c，各個成員功能不同，miR-34c在形成學習記憶中發揮作用，作為潛在調控因子調控認知功能。miR-34c高表達與海馬記憶功能密切相關，其在海馬神經元中表達上調，通過對脊柱密度、樹突長度負向調節而使海馬神經元樹突變短，減少脊柱及絲狀偽足。而樹突及突觸作為記憶形成及存儲的基本結構、信號轉導的重要位點，如果受損將造成記憶功能障礙，誘發癡呆[18]。Cao等[19]研究發現，將miR-34c抑制劑注射至小鼠海馬部位，可使沉默信息調節因子2相關酶1(SIRT1)表達升高，小鼠記憶能力改善，而抑制老年鼠中miR-34c表達也可使SIRT1表達恢復，由此證實miR-34c通過介導記憶形成相關基因表達而參與調控大腦記憶能力。

研究[20]證實，癡呆患者存在不同程度血脂異常，本研究也發現隨著癡呆病患者情加重，HDL-C水平逐漸降低，LDL-C水平逐漸升高。可能因為血脂異常可使動脈粥樣硬化加速，誘使癡呆進展，病情加重。ADP主要由脂肪細胞分泌的在人體血漿中流通的蛋白質，可介導脂類代謝，調節系統中樞炎癥反應，保護血管內皮細胞功能，從而抑制癡呆進展，其水平升高可保護癡呆患者的認知功能[21]。正常生理狀態下，Hcy代謝，從而其水平較低；而代謝異常時，Hcy在體內蓄積，可激活相關神經受體，釋放氧自由基，增加鈣離子濃度，導致神經細胞中毒發生凋亡。研究顯示，Hcy水平升高2倍是癡呆發生的獨立危險因素，降低Hcy水平可幫助延緩癡呆的進展，改善預后[22]。MMSE是癡呆篩查的主要量表之一，可迅速、準確、靈敏地反映研究對象認知功能缺損程度及智力狀態。本研究結果提示，癡呆患者存在不同程度的認知功能障礙及智力缺損。與對照組比較，癡呆患者HDL-C、ADP水平及MMSE評分低，LDL-C、Hcy水平高；并且隨著癡呆病情加重，差異更為顯著。此外，癡呆患者血清miR-9表達低于對照組，血清miR-34c表達高于對照組。提示miR-9、miR-34c可能參與癡呆的發生發展過程，與有關研究[16]結果相似。可能與miR-9具有抑制神經元分化的功能有關，miR-9表達下降，加速神經元分化而進展為癡呆；miR-34c表達升高可負向調節樹突并使其受損，進而誘發癡呆。隨著癡呆病情的加重，血清miR-9表達下調更為明顯，miR-34c表達上調也更加顯著。提示兩者異常表達可作為臨床輔助評估癡呆病情嚴重程度的標記物，為臨床制訂治療方案提供指導。

本研究相關分析結果顯示，癡呆患者血清miR-9與HDL-C、ADP、MMSE評分呈正相關性，與LDL-C、Hcy呈負相關性；血清miR-9與HDL-C、ADP、MMSE評分呈負相關性，與LDL-C、Hcy呈正相關性。提示miR-9、miR-34c可能通過介導血脂異常過程而參與癡呆發病，同時其與MMSE評分相關又可作為評估癡呆病情嚴重程度的重要指標。繪制ROC曲線進一步分析顯示，血清miR-9和miR-34c可作為早期診斷癡呆的重要標志物，并且二者聯合檢測的診斷價值更高。提示聯合檢測血清miR-9、miR-34c，有助于早期診斷癡呆，從而為臨床及時制訂針對性干預方案、改善患者預后提供指導。

綜上所述，miR-9、miR-34c參與了癡呆的發病過程，并且與病情嚴重程度密切相關，早期聯合檢測可輔助診斷癡呆。本研究為回顧性分析，可為癡呆的病因學探討提供線索，下一步將開展前瞻性隊列研究，以進一步探討上述指標在癡呆發病過程中的作用。