口腔鱗狀細胞癌RASSF5A基因的甲基化及臨床意義

尹克，李天客，郭杰，張冠華，徐金榮

(1邢臺市人民醫院，河北邢臺054001；2河北醫科大學第四醫院)

口腔癌是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，其主要組織學類型為鱗狀細胞癌(鱗癌)。由于其早期癥狀不明顯，發現時大多患者已發生局部淋巴結轉移，因此預后較差，5年生存率較低。另外，由于口腔部位解剖復雜，腫瘤不能根本切除，口腔癌的復發率高達35%[1～3]。研究顯示Ras相關區域家族5A(RASSF5A)基因在多種惡性腫瘤中扮演抑癌基因的角色，且其啟動子區的甲基化是導致RASSF5A沉默的機制之一[4～9]。本研究通過分析RASSF5A基因在口腔鱗癌組織及細胞中的甲基化狀態，探討RASSF5A基因甲基化與口腔鱗癌發生發展、預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月～2013年12月于河北醫科大學第四醫院口腔科初次就診的口腔鱗癌患者49例，男28例，女21例；年齡25～79歲，平均59.3歲；飲酒24例，吸煙26例；高、中分化32例，低分化17例；淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移18例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期30例。患者均給予手術治療，術中切取口腔鱗癌組織及相應的口腔正常黏膜組織(距癌組織2.5 cm)，均經病理檢查證實，均于離體半小時內置液氮中保存。患者術前均未接受放療、化療，且無合并影響本研究結果的疾病。本研究通過醫院倫理委員會審查批準，患者及家屬均簽署知情同意書。對患者采用電話或門診復診的形式進行隨訪，每半年1次，隨訪截止至患者死亡或2019年1月28日。

1.2 口腔癌細胞來源及培養 口腔癌細胞系OC3、KB均由河北醫科大學第四醫院口腔科保留并傳代。細胞均采用常規方法進行培養，同時采用5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC，Sigma公司)終濃度5 μmol/L，進行處理，隔24 h更換培養液，培養96 h，第4天換全血清培養基培養24 h后收集細胞。

1.3 組織及細胞中RASSF5A基因甲基化檢測 采用甲基化特異性PCR(MSP)技術。采用酚-氯仿抽提法提取新鮮組織及5-Aza-dC處理前后的口腔癌細胞系中的DNA，重亞硫酸鹽轉化，經重亞硫酸鹽轉化后的DNA進行PCR擴增，用擴增出的產物行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳條帶的結果來分析目的基因甲基化狀態。經亞硫酸鹽(德國QIAGEN公司)進行處理后，單鏈DNA未甲基化胞嘧啶可以被亞硫酸氫鹽脫氨基進而轉變為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不能夠被修飾。應用Methprimer軟件設計甲基化與非甲基化引物，甲基化上游引物序列：5′-ATTTACGGGATAAAGCGCGGTTGCG-3′，下游引物序列：5′-TAAACGTCCGCTCGCCACTCTCCCG-3′，產物大小169 bp。非甲基化上游引物序列：5′-ATTTATGGGATAAAGTGTGGTTGTG-3′，下游引物序列：5′- TAAACATCCACTCACCACTCTCCCA-3′，產物大小169 bp。引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性45 s，54 ℃(甲基化)、57 ℃(非甲基化)退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；72 ℃再延伸7 min。甲基化狀態判定：①甲基化：甲基化特異性引物(M)擴增出目的條帶，而非甲基化特異性引物(U)未擴增出目的條帶；②非甲基化：非甲基化特異性引物(U)擴增出目的條帶，而甲基化特異性引物(M)則未擴增出目的條帶；③不完全甲基化：兩對引物均擴增出目的條帶，并將其記入甲基化狀態。

1.4 組織及細胞中RASSF5A mRNA表達檢測 采用RT-qPCR技術。按照TRIzol(美國SBS公司)試劑說明書從新鮮組織及5-Aza-dC處理前后的口腔癌細胞系中提取RNA，按反轉錄試劑盒(美國Promega 公司)說明書將提取的RNA反轉錄為cDNA，分別加入RASSF5A引物和GAPDH引物，擴增cDNA，將得到的PCR產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，以GAPDH作為內參照。RASSF5A上游引物序列：5′-GAGTAGCGCAGTCGCCAAAG-3′，下游引物序列：5′-GCTCGGGGTCCAATAGTAGC-3′，產物大小115 bp；GAPDH上游引物序列：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物序列：5′-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3′，產物大小104 bp。引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。95 ℃預變性10 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環；72 ℃再延伸7 min。每個樣本分別設3個復孔。采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

2 結果

2.1 組織中ASSF5A mRNA表達及甲基化情況 口腔鱗癌組織及正常黏膜組織中RASSF5A mRNA相對表達量分別為0.279±0.124、1.016±0.109，甲基化率分別為51.0%(25/49)、22.4%(11/49)。口腔鱗癌組織中RASSF5A mRNA相對表達量低于口腔正常黏膜組織(P<0.05)，甲基化率高于口腔正常黏膜組織(P<0.05)。

2.2 細胞中RASSF5A mRNA表達及甲基化情況 5-Aza-dC處理前OC3、KB細胞中RASSF5A mRNA相對表達量分別為1.010±0.175、1.002±0.125，5-Aza-dC處理后OC3、KB細胞中RASSF5A mRNA相對表達量分別為3.550±0.525、2.440±0.301。5-Aza-dC處理后，OC3、KB細胞中RASSF5A mRNA相對表達量較處理前升高(P均<0.05)，甲基化程度降低。

2.3 RASSF5A基因甲基化與患者臨床病理參數的關系 RASSF5A基因甲基化率與腫瘤淋巴結轉移、TNM分期有關(P均<0.05)，與患者性別年齡、吸煙、飲酒、腫瘤分化程度無關(P均>0.05)。見表1。

表1 RASSF5A基因甲基化與患者臨床病理參數的關系[例(%)]

2.4 RASSF5A基因甲基化與口腔鱗癌患者預后的關系 RASSF5A基因甲基化患者5年生存率為20.0%(5/25)，生存時間(26.60±3.20)個月；RASSF5A基因未甲基化患者生存率為33.3%(8/24)，生存時間(40.64±3.26)個月。二者生存率、生存時間比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

3 討論

RASSF5定位于染色體1q32.1，是RASSF基因家族的一員[10]，是Ras關聯結構域家族的腫瘤抑制因子，具有Ras關聯域和C-末端Salvador/Rassf/Hippo結構域(SARAH域)，是Ras結合蛋白[11，12]。RASSF5有3個轉錄本RASSF5A、RASSF5B和RASSF5C。研究發現，RASSF5A在多種腫瘤(胃癌、肺癌、肝癌、結腸癌等)組織中表達下調[4～7]。

本研究在口腔鱗癌組織中檢測RASSF5A基因表達，結果顯示口腔鱗癌組織中RASSF5A基因表達低于口腔正常黏膜組織，提示RASSF5A基因在口腔鱗癌組織中發揮重要作用。Steinmann等[13]發現，RASSF5A在頭頸癌組織中可能表達下調，這與本研究結果相符。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，研究表明，DNA甲基化與口腔鱗癌的發生發展密切相關，口腔鱗癌組織和口腔癌前病變組織中DNA甲基化更頻繁、水平更高[14，15]。本研究中未經5-Aza-dC處理的口腔癌細胞系中RASSF5A mRNA表達均較低；經5-Aza-dC處理后，口腔癌細胞系中RASSF5A mRNA表達均升高。提示可能由于表觀遺傳學改變導致RASSF5A基因在口腔鱗癌中表達下調。

研究發現，在多種腫瘤組織中發現了RASSF5A基因通過啟動子區高甲基化介導的表觀遺傳學失活，包括胃癌[4]、肺癌[5]、肝癌[6]、結腸癌[7]、神經系統腫瘤[8]和食管癌[9]等。推斷在口腔鱗癌中RASSF5A基因的表達沉默機制可能與RASSF5A啟動子區甲基化狀態有關。因此本研究采用MSP法對5-Aza-dC處理前后的口腔癌細胞系中RASSF5A基因啟動子區的甲基化狀態進行檢測，結果顯示KB細胞系中RASSF5A基因呈現不完全甲基化狀態，而OC3細胞系中的RASSF5A基因則呈現出完全甲基化狀態；同時對口腔鱗癌組織及相應癌旁組織中的RASSF5A基因啟動子區甲基化狀態進行研究，結果顯示在口腔鱗癌組織中RASSF5A基因甲基化率高于相應的癌旁組織，提示RASSF5A啟動子CpG島高甲基化可能是口腔鱗癌中RASSF5A基因表達下調的主要機制之一。并且從RASSF5A基因甲基化狀態和臨床病理參數的分析發現，其甲基化率與口腔鱗癌患者有無淋巴結轉移及TNM分期密切相關，進一步提示口腔鱗癌中的RASSF5A基因表達下調可能與RASSF5A基因甲基化有關。

本研究結果顯示,RASSF5A在口腔鱗癌組織中的表達低于癌旁正常組織，其啟動子區CpG島的異常高甲基化狀態可能是口腔鱗癌組織中RASSF5A表達下調的重要機制之一。研究[16]發現，通過對口腔鱗癌中關鍵基因的甲基化位點的檢測，用于尋找可能成為口腔鱗癌早期診斷的分子標記物。因此對RASSF5A作用機制的進一步深入研究，有望為口腔鱗癌的早期診斷和預防提供更為精確的靶點。