非小細胞肺癌患者外周血ctDNA中EGFR基因突變檢測的臨床意義

陳學瑜，羅芳秀，趙廣垠，朱良綱

(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院，上海201801)

肺癌是呼吸系統最常見的惡性腫瘤，近年其發病率與病死率有逐漸增高趨勢。我國肺癌發病率5.88/萬人，預后差，5年生存率僅為20.99%[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的病理類型，目前其尚缺乏有效的早期篩查手段，發現時患者多為晚期，并已存在遠處轉移[2],常規放化療效果不佳。研究表明，NSCLC組織中表皮生長因子受體(EGFR)外顯子19缺失及外顯子21 L858R置換突變時，予以分子靶向藥物如EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療，能有效縮小病灶，延長患者生存時間，提高患者生活質量[3]。但由于晚期NSCLC患者缺乏手術切除的腫瘤組織標本，并且纖維支氣管鏡、經皮肺穿刺活檢等手段獲取的腫瘤組織有限，難以根據EGFR基因突變情況選擇是否予以TKI治療[4]。近年來隨著新的診斷技術的發展，可檢測患者外周血來源于腫瘤的游離DNA(ctDNA)中EGFR基因突變，其敏感性、特異性及穩定性較高[5]。本研究檢測NSCLC患者外周血ctDNA中EGFR基因突變，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年2月～2018年2月本院診治的晚期NSCLC患者77例，男46例，女31例；年齡37～81(58.2±7.3)歲；肺腺癌59例，肺鱗狀細胞癌(鱗癌)18例；有吸煙史29例；漢族72例；腫瘤分期[6]均為Ⅳ期；美國東部腫瘤協作組(ECOG)體能狀態評分：0～1分55例，≥2分22例。納入標準：均經病理檢查確診為NSCLC；年齡≥18歲；治療前未接受其他抗腫瘤治療；具有至少1個可評價的腫瘤病灶。排除標準：臨床資料不完整；伴其他惡性腫瘤、急性傳染病；收集的血液樣本量不足或被污染；伴明顯的心、肝、腎等臟器功能損害。本研究經醫院倫理委員會審核批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 治療方法與療效評價 患者均予以TKI治療，TKI藥物種類根據臨床經驗進行選擇，吉非替尼250 mg口服，1次/d；厄洛替尼150 mg口服，1次/d。治療期間密切監測患者血尿常規、肝腎功能，并做心電圖檢查，直至出現嚴重的患者不能耐受的不良反應，或出現腫瘤進展、遠處轉移停止治療。采用實體瘤評價標準進行近期療效評價[7]，完全緩解(CR)：全部病灶已消失；部分緩解(PR)：腫瘤灶最大徑縮小>30%；穩定(SD)：腫瘤灶最大徑變化20%～30%；疾病進展(PD)：腫瘤灶最大徑增大>30%或出現新病灶。客觀緩解率(ORR)=(CR例數+PR例數)/總例數×100%，疾病控制率(DCR)=(CR例數+PR例數+SD例數)/總例數×100%。無進展生存時間(PFS)為自開始口服藥物治療到出現疾病進展或死亡的時間。用藥后1個月評價療效，之后每3個月復查1次，隨訪方式為門診或電話隨訪，隨訪截止至2018年3月。

1.3 外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變檢測 TKI治療前用突變擴增阻滯系統法(ARMS)檢測患者外周血ctDNA中EGFR基因突變情況。患者禁食8 h后采集清晨空腹靜脈血10 mL，置于EDTA抗凝管中室溫下2 000 g離心10 min分離上清液，8 000 g離心10 min分離血漿，取上清液置于離心管中保存于-80 ℃冰箱中待測。應用血漿游離DNA分離試劑盒(艾德生物公司)提取患者血漿游離DNA，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。應用NanoDrop 2000核酸定量測定儀對DNA的濃度進行定量測定，吸光度(OD)260與OD280比值為1.8～2.0。應用ARMS在熒光定量PCR儀上對外周血ctDNA中EGFR基因突變進行檢測，實驗步驟嚴格按照試劑盒(艾德生物公司)說明書進行操作。同時對腫瘤組織中EGFR基因突變進行檢測，樣本均為甲醛固定石蠟包埋的標本，每個樣本切片8張，應用DNA提取試劑盒提取DNA(廈門艾德生物公司)，測定濃度后保存于-20 ℃冰箱中，ARMS檢測步驟同上。突變結果根據試劑盒說明書進行判定，基因突變含量>1%，突變Ct值≥29判定為基因突變。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計數資料以率(%)表示，組間比較采用χ2或Fisher確切概率法。Kaplan-Meier生存分析(Log-rank檢驗)基因突變與患者生存預后的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變比較 外周血ctDNA中EGFR基因野生型46例，突變型31例，其中外顯子19缺失突變型16例、外顯子21 L858R錯義突變型12例、外顯子20 T790M突變型3例。腫瘤組織中EGFR基因突變33例(42.9%)，其中外顯子19缺失突變型14例、外顯子21 L858R錯義突變型16例、外顯子20 T790M突變型3例。外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變率比較差異無統計學意義(P=0.744)，二者EGFR基因突變位點分布比較差異無統計學意義(P=0.814)。

2.2 外周血ctDNA中EGFR基因突變與NSCLC患者臨床病理參數的關系 腺癌患者的EGFR基因突變率高于鱗癌患者，不吸煙患者的EGFR基因突變率高于吸煙患者(P均<0.05)；外周血ctDNA中EGFR基因突變與患者年齡、性別、民族及ECOG評分無關(P均>0.05)，見表1。

表1 外周血ctDNA中EGFR基因突變與NSCLC患者臨床病理參數的關系(例)

2.3 外周血ctDNA中EGFR基因突變與近期療效及預后的關系 77例患者中，CR 0例、PR 31例、SD 29例、PD 17例。不良反應均為1、2級腹瀉與皮疹，未發生3、4級不良反應，無患者因嚴重不良反應退組或減少用藥劑量。外周血ctDNA中EGFR基因突變型患者CR 0例、PR 19例、SD 10例、PD 2例，ORR 19例(61.3%)，DCR 29例(93.5%)；野生型患者CR 0例、PR 12例、SD 19例、PD 15例，ORR 12例(26.1%)，DCR 31例(67.4%)。外周血ctDNA中EGFR基因突變型患者ORR、DCR均高于野生型患者(P均<0.05)。至隨訪結束，共51例患者出現疾病進展或死亡，外周血ctDNA中EGFR基因突變型和野生型患者中位PFS分別為9、4個月，突變型患者中位PFS長于野生型患者(P=0.022)。

3 討論

NSCLC的傳統治療方法是以鉑類為基礎的多周期化療，但毒性反應限制了化療的臨床應用。近年來隨著針對不同生物靶點的靶向藥物的出現，如TKI、針對血管內皮生長因子受體的單克隆抗體等，患者長期生存和預后有所改善。EGFR是一種含486個氨基酸受體蛋白，相對分子質量約170 kD，其結構分為胞外區、跨膜區及胞內區，是第1個被鑒定為與表皮生長因子結合的具有酪氨酸激酶活性的受體。EGFR的磷酸化對細胞增殖及細胞內信號轉導有重要作用，參與了肺癌、胃癌、胰腺癌及腎癌等多種不同類型腫瘤的發病和進展[8]。因此，EGFR已被認為是癌癥治療的重要分子靶標，并且已經開發和研究了部分抗EGFR抑制劑，包括單克隆抗體或小分子TKI。目前美國食品藥品管理局批準上市的TKI包括吉非替尼、厄洛替尼等，該類藥物與細胞毒類藥物相比，能延長EGFR陽性的NSCLC患者總體生存時間和PFS。NSCLC患者中EGFR基因突變狀態在EGFR-TKI的治療反應中起重要作用。但10%～15%的NSCLC患者無法獲取足夠的腫瘤組織進行分子檢測。

ctDNA是細胞壞死或凋亡后釋放入外周血的DNA，是來源于腫瘤細胞的游離DNA。外周血ctDNA水平可反映腫瘤組織中基因的突變狀態，但外周血中ctDNA水平低，很難被檢測到。隨著診斷技術的發展，ARMS、液相色譜分析技術等可檢測到低水平的ctDNA。研究表明，與健康人群相比，NSCLC患者外周血ctDNA水平明顯升高，并且與原發腫瘤組織具有一致性[9]。本研究比較外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變情況，結果表明外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變具有較好的一致性。兩種標本中EGFR基因突變率差異無統計學意義，且二者突變位點也較一致，結果與以往研究[10]一致。因此在無法獲取腫瘤組織時，檢測外周血ctDNA的EGFR基因突變可能是一種合理的替代方法。

本研究進一步研究外周血ctDNA中EGFR基因突變與患者臨床病理參數的關系，結果表明，外周血ctDNA中EGFR基因突變與腫瘤病理類型、患者吸煙史有關，腺癌的EGFR基因突變率高于鱗癌，不吸煙患者高于吸煙患者，而與年齡、性別、民族及ECOG評分無關。周建婭等[11]研究表明，NSCLC患者EGFR基因突變多見于腺癌、女性及不吸煙的患者。目前已明確吸煙是肺癌的重要病因，但不吸煙患者的EGFR基因突變率明顯升高，其機制尚不清楚，原因可能為吸煙與不吸煙患者腫瘤發生的分子機制不同，涉及的驅動基因和信號傳導通路也不同[12]。癌癥基因組圖譜研究網絡數據庫中，肺腺癌患者的驅動基因主要為TP53、KRAS及EGFR基因，而在肺鱗癌患者中，KRAS及EGFR基因突變較為少見[13]。本研究未發現EGFR基因突變與性別有關，可能與樣本少有關，需多中心、大樣本進一步深入研究。

近年來，雖然新的細胞毒藥物、免疫治療藥物等提高了抗癌的療效，但在延長患者的總體生存時間、PFS及生活質量上，尚無滿意的結果。本研究進一步研究外周血ctDNA中EGFR基因突變與患者近期療效的關系，結果表明外周血ctDNA中EGFR基因突變患者的ORR、DCR均高于野生型患者。研究表明，與標準化療相比，EGFR敏感突變的NSCLC患者應用吉非替尼、厄洛替尼TKI治療的ORR較高[14]。EGFR基因的突變包括19外顯子缺失、21外顯子L858R突變及18外顯子的G719X突變，上述突變可引起野生型結構中維持激酶非活性狀態的疏水殘基結構的破壞，引起EGFR持續活化，因此予以TKI治療的有效率較高[15]。此外，本研究中ctDNA中EGFR基因突變型患者的中位PFS明顯優于野生型患者，與以往報道[16]一致。因此，晚期NSCLC患者選擇治療方案之前，應對EFGR的突變狀態進行檢測，從而對靶向治療效果進行預測，以便選擇最優的治療方案[17]。

綜上所述，在缺乏腫瘤組織標本時，檢測NSCLC患者外周血ctDNA中EGFR基因突變是一種可行的替代方式，有助于治療方案的選擇及預后判斷。但本研究限于樣本較少，有待進一步開展前瞻性、多中心、大樣本的臨床研究。