宮頸癌組織中CXCL13、Dyrk1b蛋白表達變化及意義

吳麗，楊俊，唐真姿

(湖南省腫瘤醫院，長沙410006)

宮頸癌是由人乳頭瘤病毒感染引起的女性生殖系統惡性腫瘤，具有較強的侵襲性，易發生遠處轉移。晚期宮頸癌患者預后較差，其5年生存率僅為15%[1]，嚴重危害女性生命健康。近年來隨著篩查技術的普及，可早期采取干預措施，對改善患者預后有積極意義，但宮頸癌的發病存在年輕化趨勢。目前，手術根治性腫瘤切除、淋巴結清掃及輔助放化療是臨床最常見的宮頸癌治療方法，雖然在一定程度上降低了患者病死率，但術后復發及轉移仍是影響預后的重要因素。因此，尋找與宮頸癌發生發展相關的因子及預測腫瘤復發的生物學標志物是近年來研究的熱點。趨化因子能夠通過受體間的特異性結合促進腫瘤細胞的增殖與轉移，而趨化因子CXC配體13(CXCL13)主要分布于外周B細胞和T細胞亞型上，與肝細胞癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生發展、侵襲浸潤有一定相關性[2～4]。雙重特異性酪氨酸磷酸化調節激酶1b(Dyrk1b)在細胞周期及細胞凋亡過程中發揮重要作用，可使細胞處于休眠狀態而提高腫瘤生存力，在上皮性卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中呈過表達[5,6]。本研究觀察宮頸癌組織中CXCL13、Dyrk1b蛋白的表達變化，并探討二者與患者臨床病理參數及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年5月～2017年12月本院收治的宮頸癌患者77例，均行宮頸癌根治術，術中切取癌組織及癌旁正常宮頸組織(距離腫瘤邊緣1～2 cm)，術后經病理檢查確診。患者年齡38～69(47.56±7.36)歲。納入標準：①術前均未接受化療、放療、內分泌治療或免疫治療；②臨床分期參照2009年國際婦產科聯盟(FIGO)分期標準[7]。排除標準：①術前有陰道用藥等宮頸治療史；②合并其他臟器惡性腫瘤；③妊娠；④組織伴嚴重出血壞死而影響免疫組化結果。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 宮頸癌組織及癌旁正常組織中CXCL13、Dyrk1b蛋白表達檢測 采用免疫組化法。組織標本經10%甲醛固定48 h，常規石蠟包埋，Leica石蠟切片機4 μm厚度連續切片，常規SP法免疫組化染色，實驗步驟嚴格按照SP二步染色法試劑盒說明書進行。經室溫脫蠟、水化后，檸檬酸鹽緩沖液高壓加熱進行熱抗原修復。一抗抗體采用鼠抗人CXCL13單克隆抗體(上海酶研生物科技有限公司)及兔抗人Dyrk1b(武漢博士德生物工程有限公司)單克隆抗體，CXCL13一抗的稀釋濃度均為1∶50，Dyrk1b一抗的稀釋濃度均為1∶100。置入4 ℃孵箱過夜，復溫，二抗反應，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水，封片。已知陽性切片作為陽性對照，以磷鹽酸緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：組織切片于高倍鏡下隨機選定視野，鏡下計數1 000個細胞，計算均值。染色程度評分：無染色為0分，輕度染色(淺黃色)為1分，中度染色(棕黃色)為2分，重度染色(棕褐色)為3分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分比<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～75%為2分，>75%為3分。將以上兩項評分相加，分值≥4分為蛋白陽性表達[8]。

1.3 術后隨訪 77例宮頸癌患者均采用電話和門診隨訪，隨訪截止至2018年9月30日，隨訪時間為9～40個月，中位隨訪時間33個月。以確診時間為起點，以患者死亡、失訪或最近一次隨訪時間生存為終點。

2 結果

2.1 宮頸癌組織及癌旁正常組織中CXCL13、Dyrk1b蛋白表達比較 宮頸癌組織及癌旁正常組織中CXCL13蛋白陽性表達率分別為63.64%(49/77)、0，Dyrk1b蛋白陽性表達率分別為在80.52%(62/77)、14.29%(11/77)，宮頸癌組織中CXCL13、Dyrk1b蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織(P均<0.05)。

2.2 CXCL13、Dyrk1b蛋白陽性表達與患者臨床病理參數的關系 CXCL13蛋白陽性表達與腫瘤直徑、FIGO分期、淋巴結轉移、浸潤深度、組織分化程度有關(P均<0.05)，而與患者年齡、大體形態無關(P均>0.05)；Dyrk1b蛋白陽性表達與腫瘤直徑、FIGO分期、淋巴結轉移及浸潤深度有關(P均<0.05)，而與患者年齡、組織分化程度、大體形態無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 宮頸癌組織中CXCL13與Dyrk1b蛋白表達的相關性 經Spearman等級相關分析，宮頸癌組織中CXCL13與Dyrk1b蛋白表達呈正相關(r=0.361，P=0.023)。

2.4 CXCL13、Dyrk1b蛋白陽性表達與宮頸癌患者預后的關系 77例宮頸癌患者均成功隨訪，無失訪病例，共12例患者在3年內死亡，3年生存率為84.42%(65/77)。CXCL13蛋白陽性表達患者49例，死亡11例，3年生存率為77.55%(38/49)；CXCL13蛋白陰性表達患者28例，死亡1例，3年生存率為96.42%(27/28)。二者3年生存率比較差異有統計學意義(P<0.05)。Dyrk1b蛋白陽性表達患者62例，死亡12例，3年生存率為80.64%(50/62)；Dyrk1b蛋白陰性表達患者15例，死亡0例，3年生存率為100.00%(15/15)。二者3年生存率比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 CXCL13、Dyrk1b蛋白陽性表達與患者臨床病理參數的關系[例(%)]

圖1 CXCL13蛋白陽性與陰性患者生存曲線

3 討論

宮頸癌是發生于宮頸、陰道或移行帶鱗柱交界處的女性生殖系統惡性腫瘤[9]，其發病率位居女性生殖系統腫瘤的第一位，嚴重危害女性健康。隨著宮頸癌篩查手段的普及，宮頸癌的早期診斷率得到提高，能夠明顯改善患者預后，但晚期宮頸癌術后復發及遠處轉移依然是影響患者遠期生存率的重要因素。惡性腫瘤的發生發展及浸潤轉移是由各種信號傳導、趨化因子、轉錄因子等途徑共同實現，因此，尋找識別新型宮頸癌發展相關的因子及預測預后的標志物是近年來研究的熱點。

圖2 Dyrk1b蛋白陽性與陰性患者生存曲線

CXCL13是來自于趨化因子家族的細胞因子，對B細胞具有選擇性趨化作用，又稱B細胞趨化因子，其編碼基因位于人染色體4q21，調控腫瘤細胞的生長、增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，最終誘發惡性腫瘤的發生發展[10]。多項研究表明，CXCL13在肝癌、乳腺癌、胃癌組織中均呈高表達，且其表達率與患者術后生存率相關[11～13]。Xu等[12]研究發現，CXCL13抑制劑能夠縮小腫瘤體積，降低CXCR5/ERK信號通路關鍵成員CXCL13、CXCR5和ERK的mRNA和蛋白表達。由此推測CXCL13抑制劑可能通過作用于CXCR5/ERK信號通路來減弱腫瘤組織的生長。本研究發現癌旁正常組織CXCL13蛋白陰性表達，且宮頸癌腫瘤越大、臨床分期越高、浸潤深度越深、組織分化越差及有淋巴結轉移的患者CXCL13蛋白陽性表達率越高，且CXCL13陽性患者累積生存率低于陰性患者，與Chen等[14]研究相符。可見CXCL13在宮頸癌的惡性進展過程中發揮重要作用，其高表達提示預后不良，這可能與CXCL13促進腫瘤新生血管的生成及腫瘤細胞的增殖活化、轉移有關。

Dyrk1b是雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶的成員，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于人19號染色體，具有穩定蛋白結構、促進細胞增殖等作用，在多種惡性腫瘤中均呈過度表達，Dyrk1b通過穩定cyclin依賴性激酶抑制劑p27Kip1和誘導cyclin D降解來使細胞處于靜止期[15]。Lin等[16]研究發現，Dyrk1b在宮頸癌組織及細胞中均呈過表達，其表達隨著宮頸病變進展而增加。AZ191作為Dyrk1b的抑制劑，可誘導細胞凋亡，抑制宮頸癌細胞的增殖及侵襲。且研究表明，Dyrk1b基因敲除后能夠通過改變調控腫瘤細胞增殖分化相關蛋白bcl-2的結構和化學性質，抑制腫瘤細胞分化、誘導細胞凋亡[17]。本研究結果顯示，Dyrk1b高表達于宮頸癌組織，且宮頸癌腫瘤越大、臨床分期越高、浸潤深度越深及淋巴結轉移的患者組織中Dyrk1b蛋白陽性表達率越高，與相關研究[18]結果相符。Chen等[19]研究顯示，Dyrk1B通過磷酸化FoxO1參與乳腺癌的進展，Dyrk1B在乳腺癌組織和細胞中過表達，且其表達與腫瘤大小、分級等有關，Dyrk1b高表達預示患者預后較差。本研究中Dyrk1b陽性表達患者累積生存率低于陰性表達患者，可見Dyrk1b與宮頸癌的惡性進展及預后均密切相關。此外，本研究發現宮頸癌組織中CXCL13與Dyrk1b的表達呈正相關，提示二者之間可能存在某種直接或間接作用關系，有待進一步深入探討其中的機制。

綜上所述，CXCL13、Dyrk1b蛋白在宮頸癌組織中呈高表達，二者均在宮頸癌的發生發展、轉移及浸潤方面發揮重要作用，且CXCL13與Dyrk1b的表達呈正相關。CXCL13與Dyrk1b的作用機制仍需多中心、大樣本的研究深入討論，二者有望作為預測預后的指標或作為潛在的治療靶點。