miR-194-5p靶向MEX3A調控肝癌細胞活性和凋亡的機制

劉占偉 祖恩霞 潘躍銀 石明宏

(1安徽醫科大學附屬省立臨床學院腫瘤內科，安徽 淮南 230001；2安徽理工大學附屬腫瘤醫院腫瘤內科；3安徽醫科大學附屬省立醫院腫瘤內科；4安徽理工大學附屬腫瘤醫院腫瘤放療科)

微小RNA(miRNA)是由19～23 nt組成的短鏈非編碼RNA小分子，與人類多種疾病的發生有關〔1〕。目前發現，30%～90 %的人類基因是由miRNA調控的，其調控網絡十分復雜〔2〕。miR-194-5p在很多癌癥中均有報道〔3〕，但其在肝癌中的報道甚少。MEX3A屬于人類 MEX3家族的一員，與MEX3B、MEX3C、MEX3D是同源基因，該家族基因具有高度保守的KH結構域，該結構域可結合RNA和ssRNA，參與蛋白的DNA轉錄及mRNA翻譯〔4，5〕。有研究報道，MEX3A在膀胱癌、胃癌中表達〔6，7〕，但其在肝癌中的表達尚未見報道。本研究以肝癌細胞HepG2為研究對象，檢測HepG2細胞中miR-194-5p、MEX3A的表達，觀察過表達miR-194-5p、敲減MEX3A、過表達MEX3A對HepG2細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞HepG2、正常肝細胞L02均購自美國菌種保藏中心(ATCC)；DMEM培養基、胎牛血清、噻唑藍(MTT)試劑、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學發光(ECL)發光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將HepG2、L02細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640/DMEM培養基，置于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中常規培養，待細胞生長至融合度約75%，用胰蛋白酶消化1 min，按照1∶3的比例更換培養基，每2 d傳代1次。

1.2.2細胞轉染 將miR-194-5p mimics、miR-NC、si-MEX3A、si-con、miR-194-5p+pcDNA-MEX3A、miR-194-5p+pcDNA按照脂質體LipofectamineTM2000說明書操作步驟轉染至HepG2細胞，分別標記為miR-194-5p 組、miR-NC組、si-MEX3A組、si-con組、miR-194-5p+pcDNA-MEX3A組、miR-194-5p+pcDNA組，轉染后培養48 h，用qRT-PCR檢測轉染效率。轉染成功后，用于后續試驗。

1.2.3qRT-PCR實驗 取適量對數生長期1.2.2各組細胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求提取RNA，進行定量，然后按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書檢測miR-194-5p、MEX3A。采用2-△△Ct計算miR-194-5p、MEX3A的表達。

1.2.4Western印跡實驗 收集1.2.2各組細胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于EP管，加入5倍SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加發光液，曝光。

1.2.5MTT實驗 取適量1.2.2各組細胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，使結晶溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞的活力與細胞的OD值呈正比。

1.2.6Annexin V-FITC/PI流式細胞術實驗 用結合緩沖液 500 μl 懸浮1.2.2各轉染組細胞，分別加入5 μl的 Annexin V-/FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細胞儀分析測定結果。細胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測實驗 構建WT-MEX3A(含MEX3A 3'UTR片段)和MUT-MEX3A(含MEX3A 3'UTR片段突變體)的熒光素酶報告載體，采用LipofectamineTM2000分別將WT-MEX3A和MUT-MEX3A與miR-194-5p mimics、miR-NC共轉染，分別標記為miR-194-5p 組、miR-NC組,轉染后培養24 h，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作，記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發值，以兩者的比值評價MEX3A基因的激活程度。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1miR-194-5p和MEX3A在肝癌HepG2細胞和正常肝細胞L02中的表達 與L02組相比，HepG2組細胞中miR-194-5p表達顯著降低，MEX3A mRNA和蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 MEX3A蛋白表達

2.2過表達miR-194-5p對肝癌HepG2細胞增殖的影響 與miR-NC組相比，miR-194-5p組HepG2細胞中miR-194-5p表達顯著升高，48、72 h時細胞活性顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1 miR-194-5p和MEX3A在肝癌HepG2細胞和正常肝細胞L02中的表達

表2 過表達miR-194-5p對肝癌HepG2細胞增殖的影響

2.3過表達miR-194-5p對肝癌HepG2細胞凋亡的影響 與miR-NC組〔(6.79±0.71)%〕相比，miR-194-5p組HepG2細胞凋亡率〔(18.34±1.22)%〕顯著升高(t=14.172,P=0.000)。

2.4抑制MEX3A表達對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組相比，si-MEX3A組HepG2細胞中MEX3A表達顯著降低(圖2)，48、72 h時細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表3。

圖2 MEX3A蛋白表達

表3 抑制MEX3A表達對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響

2.5miR-194-5p靶向調控MEX3A的表達 運用miRcode數據庫預測到miR-194-5p與MEX3A 3'UTR存在結合位點(圖3)。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-NC組(1.01±0.09)相比，miR-194-5p組WT-MEX3A細胞中熒光活性(0.39±0.04)顯著降低(t=10.904,P=0.000)，MUT-MEX3A細胞中熒光活性不受影響(miR-NC組：0.97±0.08，miR-194-5p組：0.99±0.07；t=0.326，P=0.761)。與miR-NC組(0.51±0.05)相比，miR-194-5p組細胞中MEX3A表達(0.19±0.03)顯著降低；與anti-miR-NC組(0.48±0.04)相比，anti-miR-194-5p組細胞中MEX3A表達(0.82±0.07)顯著升高，均具有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.6MEX3A過表達逆轉了過表達miR-194-5p對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的作用 與miR-NC組相比，miR-194-5p組HepG2細胞中MEX3A表達顯著降低；48、72 h時細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；與miR-194-5p+pcDNA組相比，miR-194-5p+pcDNA-MEX3A組HepG2細胞中MEX3A表達顯著升高，48、72 h時細胞活性顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5，表4。

圖3 MEX3A的3’UTR中含有與miR-194-5p互補的核苷酸序列

1～4分別為：miR-NC組，miR-194-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-194-5p組圖4 各組MEX3A蛋白表達

1～4分別為：miR-NC組，miR-194-5p組，miR-194-5p+pcDNA組，miR-194-5p+pcDNA-MEX3A圖5 MEX3A蛋白表達

表4 MEX3A過表達逆轉了過表達miR-194-5p對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的作用

與miR-NC組比較：1)P<0.05；與miR-194-5p+pcDNA組比較：2)P<0.05

3 討 論

miRNA在癌癥中的調控作用已得到普遍認可〔6〕。同一個miRNA在不同癌癥中可能發揮不同的作用，同一個miRNA在同一個組織中的不同生長期(胚胎期、成熟期)或癌癥和疾病的不同階段的表達也是不同的〔7,8〕，但miR-194-5p在肝癌中的研究甚少。卓麗娟等〔9〕通過miRNA芯片檢測肝癌細胞中的差異表達miRNA中發現，miR-194的表達出現異常升高。Kong等〔10〕研究報道，miR-194-5p在肝癌組織和細胞系中的表達均出現異常降低，并且通過CCK8法和克隆形成實驗及Transwell實驗驗證過表達miR-194-5p可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究運用qRT-PCR、Western印跡檢測了HepG2細胞中miR-194-5p的表達，結果與Kong等〔10〕的結果一致，但與卓麗娟等〔9〕的發現相悖。這為miR-194-5p的功能研究提供了參考，也為肝癌中miR-194-5p的研究提供了理論依據。進一步研究，通過MTT法和流式細胞術檢測了HepG2細胞的活性和凋亡，發現過表達miR-194-5p可抑制HepG2細胞的活性并促進細胞凋亡，提示miR-194-5p在肝癌中的潛在治療作用。通過生物信息學預測發現，miR-194-5p與MEX3A存在互補的結合位點，又運用雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證了miR-194-5p靶向MEX3A，且miR-194-5p可負向調控MEX3A的表達。

最新研究發現，MEX3A和MEX3B同為細胞質處理小體(P小體)的重要組成部分，主要參與mRNA的降解或抑制〔11,12〕。外國學者報道，MEX3可能通過泛素化參與了mRNA的調控〔13〕。MEX3A參與機體多種疾病的進展，包括癌癥，但其在肝癌中的作用研究很少。Jiang等〔14〕在胃癌的研究中發現，敲除MEX3A可抑制胃癌細胞的集落形成、遷移和侵襲，并在體內可抑制腫瘤的生長，MEX3A在癌組織和胃癌細胞中的表達均出現明顯的升高。Pereira等〔15〕、Krepischi等〔16〕的研究均提示MEX3A為致癌基因，但并未繼續深入研究其對癌細胞表型的影響。房超等〔17～19〕的系列研究顯示，下調MEX3A在膀胱癌中的表達可抑制膀胱癌細胞增殖，促進膀胱癌細胞凋亡，發揮抑制膀胱癌細胞進一步惡化的治療作用。本研究檢測了肝癌細胞HepG2中MEX3A的表達，結果顯示，MEX3A在HepG2細胞中的表達明顯高于正常肝細胞L02中的表達，這是國內外首次發現MEX3A在肝癌細胞中的表達。但本研究的不足之處在于未在肝癌組織中檢測MEX3A的表達，不能更充分地證明MEX3A在肝癌中的作用。這也為后續研究MEX3A在肝癌中的潛在治療價值提供了理論依據。進一步研究發現，敲減MEX3A可抑制HepG2細胞的增殖并促進其凋亡，這預示著抑制MEX3A可在肝癌中發揮治療作用。過表達MEX3A具有與敲減MEX3A相反的作用，甚至可以逆轉過表達miR-194-5p對HepG2細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，這部分結果在一定程度上可驗證miR-194-5p與MEX3A之間的靶向調節關系，更重要的是，為miR-194-5p、MEX3A在肝癌中的作用機制研究及臨床治療價值探討奠定實驗基礎。

綜上所述，miR-194-5p可抑制肝癌細胞的增殖，促進凋亡，其機制可能與靶向MEX3A有關，為肝癌精準治療的研究及應用提供參考。