地榆對子宮內膜癌細胞凋亡及炎癥因子表達的影響

劉維 楊譽佳 袁利

(遵義醫學院附屬醫院婦科，貴州 遵義 563003)

子宮內膜癌是常見的婦科生殖系統惡性腫瘤之一，好發于更年期和絕經期婦女，其發病與生活方式密切相關，隨著生活環境、生活習慣的改變，子宮內膜癌發病率正逐年上升〔1〕。對子宮內膜癌治療方法早期以手術治療為主，晚期以放療、化療為主，這些治療方法對患者造成極大的傷害〔2〕。近年來，由于中藥治療、分子靶向治療和激素治療方法創傷小、效果佳，成為很多科研學者的研究熱點〔3，4〕。地榆是一種常見的中藥止血劑，具有止血、消炎、減少水腫、防止感染等作用，臨床上地榆用于子宮肌瘤、宮頸癌等婦科疾病的治療〔5〕。最近研究發現，地榆可使肝癌、胃癌、肺癌、宮頸癌等癌細胞在形態上發生皺縮、破裂、脫壁等變化，可不同程度地抑制癌細胞生長〔6〕。相關研究發現，子宮內膜癌的發生和發展與炎癥密切相關，一些炎癥因子、炎癥細胞、趨化因子存在于子宮內膜癌細胞和局部組織中〔7，8〕。炎癥可通過各種炎癥細胞、炎癥因子誘導炎癥通路促進子宮內膜癌細胞的增殖和遷移，一些促炎細胞因子可抑制細胞凋亡，刺激更多的促炎細胞因子的產生，反饋性調節細胞增殖，抑制細胞凋亡〔9，10〕。因此，抑制炎癥因子阻礙炎癥通路可成為干預子宮內膜癌發生和發展的一種措施。本研究通過體外分離培養人子宮內膜癌細胞，探討地榆對子宮內膜癌細胞凋亡和炎癥因子表達的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 細胞來源：子宮內膜癌HEC-1-B細胞株(上海斯信生物科技有限公司)；藥材：地榆提取液(西安金綠生物工程技術有限公司)。試劑：Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、杜爾伯科改良伊格爾培養基(DMEM)(美國Sigma公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；噻唑藍(MTT)試劑(廣州朗日生物技術有限公司)；膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒(江蘇凱基生物公司)；白細胞介素(IL)-1β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、IL-8 ELISA檢測試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測試劑盒(上海晶天生物科技公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Abcam公司)。

1.2子宮內膜癌細胞的培養 在無菌條件下取子宮內膜癌HEC-1-B細胞，培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃飽和濕度的CO2培養箱中培養，當細胞匯合度約為80%時，加入Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶消化傳代，2～4 d傳代一次，收集對數期生長的細胞，用于后續實驗。

1.3子宮內膜癌細胞分組 對子宮內膜癌HEC-1-B細胞進行分組，用含有地榆提取液終濃度為0.00 mg/ml培養液培養的細胞為對照組。用含有地榆提取液終濃度為0.25、1.00、4.00 mg/ml培養液培養的細胞分別為低、中、高濃度組。

1.4MTT檢測子宮內膜癌細胞生長抑制率 取子宮內膜癌細胞，接種到96孔細胞培養板中，按照對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組方法處理細胞，每組設6個復孔，培養48 h后，加入50 μl的0.5 mg/ml的MTT溶液到每孔細胞中，37℃孵育4 h，除去上清液后加入100 μl二甲基亞砜溶液，緩慢震蕩反應10 min，待結晶物溶化后，在490 nm處檢測各孔光密度(OD)值。以對照組測得A值為對照計算生長抑制率，細胞生長抑制率=1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。

1.5流式細胞術測定子宮內膜癌細胞凋亡 取各組細胞，培養48 h后收集細胞，用胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度為106個/ml細胞，收集1 ml細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，加入400 μl的結合緩沖液混合，再依次加入10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC，放在室溫下避光孵育5 min后，用流式細胞儀檢測子宮內膜癌細胞凋亡情況。

1.6Western印跡測定Cleaved Caspase-3和Bax的表達水平 收集各組培養48 h后的細胞，預冷的PBS漂洗后加入50 μl細胞裂解液，置于冰上充分裂解30 min后，用細胞刮刀將細胞刮下，轉移至EP管中，4℃，12 000 r/min離心10 min，吸取蛋白上清至另一EP管中，用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度。配制十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠，12%的分離膠和5%的濃縮膠。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照4∶1的比例混合煮沸反應10 min，將煮沸過的混合液加入上樣孔中，每孔加入30 μl的樣品。用60 V電壓電泳跑濃縮膠，待樣品進入分離膠和濃縮膠邊緣時，調整電壓為120 V跑分離膠。將蛋白在300 mA恒流下條件下轉印120 min至硝酸纖維素膜上。轉膜結束后，放置在5%脫脂奶粉溶液中，室溫孵育90 min，加入500倍稀釋的一抗在4℃孵育過夜，用Tween-20 Tris-鹽酸緩沖液(TBST)洗滌后加入1 000倍稀釋的二抗在室溫下孵育90 min，用TBST洗滌后，轉移到暗室中，在凝膠成像系統中曝光，以β-actin為內參，分析Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表達水平。

1.7ELISA檢測細胞培養液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α含量 取各組子宮內膜癌細胞，培養48 h后，分別收集細胞培養液上清，用ELISA法分別檢測上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α含量，步驟按照試劑盒說明書進行操作，作標準曲線，縱坐標是標準品的吸光度值，橫坐標是濃度，計算實驗各孔檢測指標的含量。

1.8統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析，組間LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1地榆對子宮內膜癌細胞生長抑制的影響 與對照組 〔(0.00±0.00)%〕相比，低濃度組〔(8.41±0.65)%〕、中濃度組〔(35.83±3.56)%〕、高濃度組細胞抑制率〔(67.87±7.13)%〕均明顯增加，中濃度組高于低濃度組，高濃度組高于中濃度組和低濃度組，差異具有統計學意義(P<0.05)。隨著地榆濃度的增加抑制率逐步升高，具有濃度依賴關系。

2.2地榆對子宮內膜癌細胞凋亡的影響 與對照組〔(9.95±1.13)%〕相比，低濃度組、中濃度組、高濃度組的凋亡率〔(23.91±2.57)%、(39.42±4.48)%、(58.44±5.89)%〕顯著升高，中濃度組高于低濃度組，高濃度組高于中濃度組和低濃度組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。這說明地榆可呈濃度依賴性地促進子宮內膜癌細胞凋亡。

圖1 地榆作用48 h后各組細胞凋亡

2.3Western印跡測定細胞中Cleaved Caspase-3和Bax的表達 與對照組相比，低濃度組、中濃度組、高濃度組Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表達水平均有所上調，其中中濃度組Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表達水平上調幅度高于低濃度組，高濃度組Cleaved Caspase-3和Bax的蛋白表達水平上調幅度高于中、低濃度組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2和表1。這說明地榆可通過凋亡相關蛋白的上調促進子宮內膜癌細胞凋亡。

圖2 Western印跡檢測各組細胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平

表1 各組細胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與低濃度組比較：2)P<0.05；與中濃度組比較：3)P<0.05；表2同

2.4地榆對子宮內膜癌細胞上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α的影響 低濃度組、中濃度組、高濃度組細胞培養上清液中IL-1β、IL-8、TNF-α的含量均低于對照組，且隨著地榆濃度的升高，細胞培養液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α的含量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。這提示地榆可以抑制子宮內膜癌細胞炎癥因子IL-1β、IL-8、TNF-α的表達。

表2 各組細胞中IL-1β、IL-8、TNF-α含量

3 討 論

隨著生活水平的提高、科學技術的發展，人們的思想觀念也逐步發生改變，從追求治愈到提高腫瘤患者的生存質量〔11〕。因此，尋找安全有效、副作用較小的治療措施的研究備受關注，近年來利用中藥預防子宮內膜癌成為研究的熱點。一些中藥可促進子宮內膜癌細胞的凋亡〔12〕。地榆是薔薇科地榆屬多年生草本植物的中草藥，具有涼血止血、抗菌消炎、抗氧化、抗過敏等作用。目前已有研究報道地榆可通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡達到抗腫瘤的作用〔13〕。有報道證實，地榆皂苷類化合物可顯著抑制甲狀腺乳頭癌細胞增殖、促進細胞凋亡，且呈劑量依賴性〔14〕。地榆可有效抑制人子宮頸癌細胞JTC-26、宮頸癌細胞Hela的生長〔5〕。本研究說明地榆可以抑制子宮內膜癌細胞生長，誘導細胞凋亡，具有抗癌作用，與上述報道類似。

促凋亡蛋白Bax是線粒體通路激活的關鍵分子，Bax參與細胞色素C從線粒體中釋放，線粒體膜電位的改變及內質網鈣離子濃度的調節，還可激活Caspase蛋白酶的級聯反應，啟動線粒體通路介導的細胞凋亡，最終導致細胞凋亡〔15〕。從雷公藤中提取的主要活性物質雷公藤甲素可抑制子宮內膜癌細胞的增殖，且呈現一定劑量依賴性，還可上調Caspase-3的表達，通過激活依賴Caspase的線粒體凋亡途徑促進子宮內膜癌細胞的凋亡〔16〕；用不同濃度的紫草素作用于子宮內膜癌Ishikawa細胞，48 h后檢測Bax和Bcl-2的表達量，發現隨著紫草素濃度的增加Bax和Bcl-2的表達量也上升，紫草素通過上調Bax的表達，下調Bcl-2的表達，誘導子宮內膜癌細胞凋亡〔17〕；地榆類化合物作用于胃癌細胞，可調節細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達，激活Caspase-3通路促進細胞凋亡〔18〕。本實驗證實了地榆可以通過調控Caspase和Bax的表達影響子宮內膜癌細胞凋亡。

在許多腫瘤細胞上清中可檢測到炎癥因子含量比正常細胞中高，研究認為，過量表達的炎癥因子往往與腫瘤疾病的發生密切相關〔19，20〕。腫瘤的發生和發展與微環境中存在的炎癥因子有關，各種炎癥介質有利于腫瘤細胞的增殖和遷移，通過炎癥信號通路抑制腫瘤細胞的凋亡〔21〕。流行病學數據顯示，子宮內膜癌的危險因素之一是炎癥因子的產生，炎癥因子在子宮內膜癌細胞中分泌增多，檢測子宮內膜癌中細胞IL-6蛋白表達上調，IL-6可通過調節細胞外調節蛋白激酶(ERK)-核因子(NF)-κB信號通路促進子宮內膜癌細胞增殖〔22〕。TNF-α可促進子宮內膜癌細胞的浸潤生長，還可促進子宮內膜癌上皮細胞的增殖〔23〕。因此，通過抑制和干擾炎癥因子的產生可為子宮內膜癌的治療提供新的方向。本研究提示地榆可以減少子宮內膜癌炎癥因子表達。

地榆促進子宮內膜癌細胞凋亡，抑制炎癥因子的分泌，在子宮內膜癌發生和發展中發揮作用。炎癥因子可能通過特定的信號通路促進子宮內膜癌的發展，因此，通過地榆抑制炎癥形成過程中的炎癥因子可為子宮內膜癌的治療提供新的方向。