抑制LncRNA MALAT1靶向促進miR-200a表達減少心肌細胞凋亡

李家睿 閆波

(1山東大學齊魯醫學院心血管內科,山東 濟南 250012;2濟寧醫學院附屬醫院中心實驗室)

心肌細胞損傷是心血管系統疾病常見的病理變化〔1〕。目前研究認為，氧化應激是引起心肌損傷的重要原因，其可以誘導細胞凋亡發生，從而導致心肌組織完整結構受到破壞，引起心肌功能損傷〔2〕。LncRNA是近年來發現的與人類生理和病理功能密切相關的非編碼RNA，其參與調控細胞的分化、凋亡等過程〔3〕。LncRNA 肺腺癌轉移相關轉錄因子(MALAT)1最先在非小細胞肺癌細胞中發現，參與腫瘤進展〔4〕。研究發現，MALAT1還參與內皮細胞生長、動脈粥樣硬化、視網膜病變等生理和病理過程〔5～7〕。最近研究顯示，MALAT1在心肌細胞損傷過程中表達上調，下調MALAT1能夠抑制脂多糖(LPS)誘導的心肌細胞凋亡〔8〕。目前對于MALAT1在氧化應激條件下心肌細胞凋亡中的作用尚不明確。本研究以過氧化氫(H2O2)處理心肌細胞構建氧化應激損傷模型，探討MALAT1對氧化應激條件下心肌細胞凋亡的影響和機制。

1 材料與方法

1.1材料 心肌細胞H9c2購自湖南豐暉生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；MALAT1 siRNA、siRNA control、miR-200a mimics、mimics control由吉滿生物科技(上海)有限公司合成；熒光素酶報告載體由南京科佰生物科技有限公司構建；miR-200a inhibitor、inhibitor control由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；丙二醛(MDA)含量測定試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)水平測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2Realtime PCR檢測H2O2處理后心肌細胞中MALAT1表達 心肌細胞分別用0和100 μmol/L的H2O2處理，分別為Control組和H2O2組。細胞培養24 h后，Realtime PCR測定MALAT1表達變化。在細胞中添加Trizol試劑，提取細胞總RNA，RNA以RNase-free水溶解，使用紫外分光光度計檢測RNA OD260/OD280的比值在1.8～2.0。取1 μg RNA模板，反轉錄合成cDNA，反轉錄步驟同cDNA合成試劑盒，反轉錄條件：42℃孵育60 min，72℃孵育10 min，-20℃保存備用。根據PCR引物進行SYBR Green實時定量PCR，PCR條件：95℃，2 min；95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；共循環40次。MALAT1正義5′-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3′，反義5′-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3′。GA-PDH正義5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，反義5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

1.3細胞轉染 取心肌細胞，放在37℃，5%CO2培養箱中培養，細胞密度生長到60%時，取出細胞培養板，按照Lipofectamine2000進行細胞轉染，細胞轉染步驟同轉染試劑說明。將轉染MALAT1 siRNA和siRNA control后的心肌細胞用含有100 μmol/L的H2O2培養液培養，記為H2O2+si-MALAT1組和H2O2+si-NC組。細胞培養24 h后，按照1.2中Realtime PCR方法測定細胞中MALAT1表達變化，評估下調效果。

1.4細胞凋亡檢測 使用流式細胞術檢測細胞凋亡變化，收集已經培養24 h的Control、H2O2、H2O2+si-NC、H2O2+si-MALAT1細胞，細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，添加提前在4℃預冷后的磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞懸浮2次，然后添加300 μl結合緩沖液，依次加入5 μl碘化丙啶(PI)和膜聯蛋白(Annexin) V-FITC溶液，避光混勻。在上流式細胞儀檢測之前添加100 μl結合緩沖液混勻。

1.5SOD和MDA含量檢測 收集已經培養24 h的Control、H2O2、H2O2+si-NC、H2O2+si-MALAT1細胞，分別用試劑盒檢測細胞中SOD和MDA水平，步驟完全按照試劑盒標準流程。

1.6靶基因預測和熒光素酶系統鑒定 使用生物信息學軟件(starbase)預測MALAT1靶基因，發現miR-200a與MALAT1有互補結合位點。將MALAT1的互補結合位點突變，并且構建突變型熒光素酶報告載體(MUT)，與miR-200a mimics和mimics control共轉染到細胞中，同時構建沒有突變的野生型熒光素酶報告載體(WT)與miR-200a mimics和mimics control共轉染。培養2 d后，利用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.7miR-200a inhibitor逆轉抑制MALAT1作用 在心肌細胞中共轉染MALAT1 siRNA和inhibitor control、MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor，用含有100 μmol/L的H2O2培養液培養，記為H2O2+si-MALAT1+Anti-NC組、H2O2+si-MALAT1+Anti-miR-200a組。按照上述方法測定細胞凋亡和MDA、SOD水平及miR-200a表達變化，步驟同上。

1.8統計分析 采用SPSS21.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1H2O2誘導心肌細胞中MALAT1表達升高 H2O2處理后心肌細胞中MALAT1水平(1.89±0.13)顯著高于Control組(1.00±0.09，t=9.750，P=0.001)，即H2O2誘導心肌細胞中MALAT1表達。

2.2MALAT1 siRNA抑制H2O2條件下心肌細胞中MALAT1表達 心肌細胞轉染MALAT1 siRNA后，H2O2+si-MALAT1組MALAT1表達水平(0.45±0.06)明顯低于H2O2+si-NC組(1.01±0.12，P<0.05)。

2.3抑制MALAT1減少H2O2誘導的心肌細胞凋亡和氧化損傷 經過H2O2處理的心肌細胞凋亡率升高，MDA含量升高，SOD活性降低。心肌細胞轉染MALAT1 siRNA后，經過H2O2處理，細胞凋亡率降低，MDA含量降低，SOD活性升高，見圖1，表1。

圖1 流式細胞術測定MALAT1 siRNA轉染后H2O2處理的心肌細胞凋亡變化

2.4MALAT1靶向調控miR-200a 生物信息學軟件發現MALAT1與miR-200a有互補結合位點(圖2)。構建MALAT1-WT和MUT熒光素酶報告載體，miR-200a mimics和WT共轉染后的細胞熒光素酶活性降低，見表2。

表1 MALAT1 siRNA轉染后對H2O2處理心肌細胞凋亡和SOD、MDA的影響

與Control組比較：1)P<0.05；與H2O2+si-NC組比較：2)P<0.05

圖2 生物信息學軟件預測MALAT1靶向調控miR-200a

表2 熒光素酶活性變化

2.5抑制MALAT1促進H2O2條件下心肌細胞中miR-200a表達 H2O2處理后心肌細胞中miR-200a表達水平(0.63±0.06)顯著低于Control組(1.00±0.10，P<0.05)，MALAT1 siRNA轉染后的心肌細胞經過H2O2處理，細胞中miR-200a水平(0.96±0.11)顯著高于H2O2+si-NC組(0.62±0.05，P<0.05)。

2.6miR-200a inhibitor逆轉抑制miR-200a對H2O2條件下心肌細胞凋亡和氧化損傷影響 與共轉染MALAT1 siRNA和inhibitor control的細胞比較，在心肌細胞中共轉染MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor，經過H2O2處理，細胞中miR-200a水平降低，細胞凋亡率升高，SOD活性降低，MDA含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor轉染后對H2O2處理心肌細胞凋亡和SOD、MDA的影響

與H2O2+si-MALAT1+Anti-NC組比較：1)P<0.05

3 討 論

缺血再灌注、心肌缺血、心臟重塑等與心血管系統疾病有關的心肌損傷過程中均會產生大量的氧自由基，這些氧自由基過度積累與細胞中抗氧化酶SOD活性降低有關，而大量的氧自由基可以誘導心肌細胞發生氧化損傷，誘導細胞凋亡發生〔9，10〕。H2O2是常見的體外誘導心肌細胞氧化應激的誘導因子，其能夠促進細胞中脂質發生過氧化，生成MDA，造成氧化損傷〔11〕。本實驗發現，H2O2處理后的心肌細胞凋亡率升高，細胞中MDA含量升高，SOD活性降低，說明成功構建了氧化應激誘導的心肌細胞損傷模型。

MALAT1又稱為NEAT2，其編碼基因定位在11q13.1染色體上，是基因之間的轉錄本，其在哺乳動物體內具有高度保守性，在生物進化過程中發揮關鍵作用〔12〕。MALAT1功能十分廣泛，具有調控細胞生長、表觀遺傳、氧化應激等作用〔13〕。以往研究顯示，MALAT1在正常細胞損傷時表達上調，下調MALAT1抑制細胞損傷發生〔14〕。在心肌細胞中的研究報道表明，MALAT1在受到白細胞介素(IL)-6、LPS等刺激后的細胞中表達異常升高，且抑制其表達能夠明顯下調心肌細胞凋亡水平，減少細胞損傷〔15〕。這些研究結果可能提示，MALAT1在細胞損傷過程中發揮促進作用。本實驗發現，H2O2處理后的心肌細胞中MALAT1表達水平升高，抑制MALAT1可以降低H2O2誘導的心肌細胞凋亡和MDA合成，提高細胞中SOD活性，說明下調MALAT1具有保護心肌細胞氧化損傷的作用，靶向抑制MALAT1可能是減輕心肌細胞氧化損傷的途徑。

目前對于MALAT1的調控機制發現，其可以靶向調控miRNA的表達發揮生物學作用，并且其靶基因有多個，在不同的組織和生理過程中靶向調控機制可能不同〔16〕。目前已知MALAT1靶基因有miR-205、miR-570-3p、miR-23c等〔17～19〕。本實驗發現，MALAT1與miR-200a有互補結合位點，并且miR-200a受到MALAT1的負調控作用。以往研究表明，miR-200a在心肌損傷中表達下調，且miR-200a能夠緩解心肌損傷程度〔20〕。本實驗發現，H2O2誘導心肌細胞中miR-200a表達下降，并且下調miR-200a可以逆轉抑制MALAT1對心肌細胞的保護作用，說明抑制MALAT1通過靶向上調miR-200a表達抑制心肌細胞氧化損傷。

總之，MALAT1在心肌損傷中可能發揮促進作用，靶向抑制MALAT1表達通過上調miR-200a降低心肌細胞氧化損傷，減少細胞凋亡，MALAT1可能是減輕心肌損傷的有效途徑。