真空包裝通過調節酶活性抑制鮮切蓮藕酶促褐變

馮向陽 謝君 王宏勛

摘要：鮮切蓮藕因失去外層組織保護而易發生褐變，而酶促褐變是主要原因。真空包裝對鮮切蓮藕的褐變有較好的延緩作用，其中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，簡稱PPO）和過氧化物酶（peroxidase，簡稱POD）的編碼基因是參與果蔬褐變的主要基因。但目前關于真空包裝對鮮切蓮藕片相關酶活性及其編碼基因表達的影響研究甚少。分析在 4 ℃ 下真空包裝對鮮切蓮藕貯藏過程中褐變度和PPO、POD活性及其編碼基因表達的影響。結果表明，真空包裝對延緩鮮切蓮藕褐變有較好效果，且在貯藏期內真空包裝鮮切蓮藕PPO、POD活性變化與其褐變度大體一致。與此同時，基因NnPPOC和NnPOD4的表達量變化對PPO、POD活性的影響與最終蓬藕的褐變度變化一致，且真空包裝對基因NnPPOA、NnPOD1/2/3的表達呈現出不同程度的抑制效果，說明真空包裝對鮮切蓮藕的NnPPOA/C和NnPOD1/2/3/4基因表達量有降低作用，進而起到延緩褐變的目的。

關鍵詞：鮮切蓮藕;褐變;酶活性;基因表達

中圖分類號： TS255.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0210-04

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）屬睡蓮科（Nelumbonaceae）多年生宿根性草本植物，是我國特色的水生蔬菜和出口創匯蔬菜，并逐漸成為最受歡迎的蔬菜之一[1-3]。近年來，隨著消費水平的提高和生活方式的變化，鮮切果蔬越來越受關注，而蓮藕因其具有營養豐富、組織脆嫩等特點逐漸成為鮮切果蔬商品化中重要的一部分[4-5]。然而，鮮切蓮藕在加工貯藏過程中極易發生酶促褐變，對其品質產生不可逆的影響，降低食用價值和縮短貨架期[6-7]，因此，抑制酶促褐變是保持鮮切蓮藕品質和延長貨架期的重要途徑。

目前控制鮮切果蔬褐變的方法可以分為保鮮劑（如L-半胱氨酸[8]、二氧化氯[9]、亞硫酸鹽[10]、過氧化氫[11]、抗壞血酸及其衍生物[12]、有機酸[13-14]、螯合劑中的乙二胺四乙酸、植酸[15-16]）處理，以及不同包裝方式（如熱處理[17]、氣調貯藏[18]、低溫貯藏[19]）處理，其中真空包裝作為保鮮技術的一種重要方式，通過抽真空來降低空氣壓力，減少包裝中的氧氣含量，從而降低果蔬的呼吸強度并抑制多酚氧化酶的活性，進而延緩鮮切果蔬的褐變進程，現有研究發現，真空包裝結合低溫貯藏能有效保持鮮切菠蘿的品質，使其褐變度明顯降低[20]。

目前研究報道顯示，PPO和POD基因參與了果蔬褐變進程[21-22]，筆者所在實驗室前期研究也發現，NnPPOA、NnPOD1-6是高溫誘導下鮮切蓮藕褐變的候選基因[19]。但是，關于真空包裝對鮮切蓮藕中PPO和POD編碼基因的影響研究甚少。因此，本試驗采用在4 ℃下真空包裝方式對在貯藏期內鮮切蓮藕的褐變度和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，簡稱PPO）、過氧化物酶（peroxidase，簡稱POD）活性變化及其編碼基因表達的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶泥蓮藕（品種為武植二號），購于武漢民生金旺果蔬批發市場;NaH2PO4、Na2HPO4、無水碳酸鈉、丙酮、磷酸、聚乙二醇6000、無水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、鄰苯二酚、愈創木酚氯仿、異戊醇、疏基乙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、Tris、LiCl、NaOH（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;30%過氧化氫（分析純，上海威奧生物科技有限公司）。

cDNA合成試劑盒、Ssofast反應試劑盒（美國Bio-Rad）;Trition X-100（Biosharp生物科技有限公司）;50×TAE（北京百奧萊博科技有限公司）;TaKaRa膠回收試劑盒、E×Tap酶反應試劑盒、DH5α（TaKaRa生物有限公司）;去除DNA試劑盒（美國Thermo）;瓊脂糖凝膠（北京沃比森科技有限公司）;DEPC（Biosharp生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

AR2140型電子分析天平[奧賽斯國際貿易（上海）有限公司];GL-20G-Ⅱ離心機（上海安亭科學儀器廠）;IMS-20雪科制冰機（常熟市雪科電器有限公司）;XHF-D內切式勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;HH-S4數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫療儀器廠）;101-3EB型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫療儀器有限公司）;DRP-9082型電熱恒溫培養箱（上海恒一科學儀器有限公司）;HYC-326A醫用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）;A360型紫外可見分光光度計[翱藝儀器（上海）有限公司];氣調包裝機成套設備（上海福帝包裝機械有限公司）;FHW-450型保鮮膜封接機（浙江江南實業有限公司）;DYCP-31DN電泳儀（北京六一儀器廠）;T100 TM Thermal Cycler PCR儀、CFX96熒光PCR儀、凝膠成像系統（美國Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理 將購買來的新鮮蓮藕運送到實驗室對其表面淤泥進行清洗，并挑選尺寸和表面顏色均勻且無損傷的蓮藕置于4 ℃下預冷24 h后，使用刀沿著蓮藕的橫截面切成5 mm厚的切片，并將其立即轉入清水中浸泡3 min，然后撈出蓮藕切片并用濾紙快速吸干表層水分，分別進行真空包裝和常壓包裝（對照）并轉入4 ℃冰箱中進行為期35 d的貯藏試驗，每盒放置鮮切蓮藕5片，每個處理時間點（貯藏0、7、14、21、28、35 d）設置3組平行。

1.3.2 褐變度的測定 通過對張京芳的鮮切蓮藕褐變檢測方法[23]進行改進，將存放于4 ℃冰箱內2種包裝方式下的蓮藕每隔7 d各取出3盒切碎，并快速稱取3.0 g置于離心瓶中，加入30 mL預冷的雙蒸水，以冰浴的方式高速勻漿20 s后，在4 ℃下以10 000 r/min的轉速離心10 min，取上清液 3.5 mL 于10 mL離心管中并在25 ℃水浴鍋中保溫5 min，于410 nm條件下測其吸光度，褐變度表示為D410 nm×10，每個處理3組平行。

1.3.3 PPO和POD活性的測定 按照之前的研究方法對PPO和POD進行提取和活性測定[19，24]。4 ℃下2種包裝方式的蓮藕切片 15 g 于冰浴的研缽中，倒入30 mL保存于 -20 ℃ 條件下的丙酮進行充分研磨后，置于通風櫥中揮發干燥，稱取1.5 g干燥后的樣品于燒杯中，加入30 mL pH值為7.0的磷酸緩沖液，充分攪拌10 min得到總酶的粗提取液，分別吸取5 mL粗酶液于2組試管中，每組3個平行，在第1組試管中先后加入15 mL pH值為7.0的磷酸緩沖液和 5 mL 鄰苯二酚，搖勻得到PPO提取液，在第2組試管中先后加入5 mL pH值為5.0的醋酸緩沖液和5 mL愈創木酚，搖勻后加入5 mL 0.1%的過氧化氫溶液得到POD提取液，通過分光光度法將PPO、POD活性單位（U）分別定義為在420、470 nm 處1 min引起吸光度改變0.001、0.01所需的酶量。

1.3.4 RNA提取和cDNA合成 根據現有的文獻提取蓮藕樣品中總RNA[25]，同時將有污染的基因組DNA痕跡從總RNA中去除，以確保檢測的準確性，并使用iScript cDNA合成試劑盒（Bio-Rad）進行相關cDNA的合成[22]。

1.3.5 實時熒光定量PCR 用于PCR分析的寡核苷酸引物在Min等的研究中已經得到驗證[25]，據此使用Ssofast EvaGreen Supermix試劑盒（Bio-Rad）和CFX96熒光PCR進行實時定量PCR，以對相關基因的表達情況開展后續研究[26]。

1.3.6 數據分析 對所得數據進行整理并使用Origin 8.0軟件進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 褐變度

如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，真空包裝鮮切蓮藕的褐變度（browning degree）僅從初始的0.260增加到0.313，而常壓包裝鮮切蓮藕的褐變度從初始的0.260增加到0.461。且真空包裝下鮮切蓮藕的褐變度明顯低于常壓包裝。因此，該結果進一步證明真空包裝對鮮切蓮藕的褐變進程有較好的延緩作用[27-28]。

2.2 真空包裝對鮮切蓮藕PPO、POD活性的影響

PPO是參與果蔬褐變最重要的酚酶[29]。如圖2所示，在4 ℃貯藏期內，2種包裝方式下鮮切蓮藕的PPO活性呈現明顯不同的增長趨勢，其中真空包裝的PPO活性從處理當天的0.452 U/g增加至貯藏35 d的0.571 U/g，而常壓包裝的PPO活性從處理當天的0.452 U/g增加至貯藏35 d的 1.311 U/g，由此可見，在貯藏期內，真空包裝能有效抑制PPO活性的增加。

POD在H2O2存在的條件下促進果蔬褐變的發生[30-31]。如圖3所示，整個貯藏期內2種包裝方式下的鮮切蓮藕POD活性均呈增加趨勢，4 ℃真空包裝下的POD活性從處理當天的0.061 U/g增加到貯藏35 d的0.095 U/g，而4 ℃常壓包裝下的POD活性從處理當0天的0.061 U/g上升到了貯藏35 d的0.144 U/g。貯藏14 d之前，2種包裝方式下POD活性未出現明顯差別，貯藏14 d后真空包裝對POD活性的升高開始產生抑制效果。

根據相關研究可知，PPO和POD參與了鮮切蓮藕的酶促褐變[32]。通過分析2種包裝方式對PPO、POD活性變化的影響發現，在貯藏期內，4 ℃真空包裝對鮮切蓮藕的PPO活性的升高產生了明顯的抑制效果，貯藏7 d后，真空包裝對POD活性的增加開始產生抑制作用，由此可以發現，真空包裝對PPO、POD活性的抑制作用有利于延緩蓮藕褐變度的增加，進而使品質得到更好的保持，此結果與前人研究報道[33-34]相一致。

2.3 鮮切蓮藕褐變相關基因NnPPO、NnPOD基因表達表達分析

由圖4可知，在真空包裝環境下，NnPPOC的表達量始終被抑制，而真空包裝在貯藏7 d后開始抑制基因NnPPOA的表達，并在貯藏35 d時基因NnPPOA的表達量最低，與常壓包裝相比，真空包裝對基因NnPPOA的表達在貯藏28 d后產生明顯的抑制作用，且常壓下基因NnPPOA、NnPPOC的表達均被誘導，這與真空包裝下PPO活性明顯低于常壓包裝相吻合。由此可知，真空包裝能通過下調NnPPOA和NnPPOC的表達來降低PPO活性。

由圖5可知，與對照組相比，真空包裝鮮切蓮藕的NnPOD1、NnPOD2、NnPOD3基因表達量在整個貯藏期內始終處于被抑制的狀態，這與酶活性的變化相吻合。在2種包裝方式的樣品中，NnPOD4和NnPOD5的表達量均呈現不同程度的增加，這可能參與到其他品質變化的調控中，有待于后期的進一步研究。NnPOD7的表達在2種包裝狀態下整體被抑制，且無明顯差異。與之不同的是，基因NnPOD6的表達被真空明顯誘導。

真空包裝對鮮切蓮藕基因NnPPOC的表達影響與PPO活性變化及蓮藕褐變程度大體同步，且在貯藏7 d后，基因NnPPOA的表達受到真空抑制作用也參與到降低PPO活性和延緩蓮藕褐變進程中;與此同時，在貯藏期內，真空包裝對蓮藕基因NnPOD1/2/3的表達始終表現出抑制效果，在貯藏7 d后，基因NnPOD4的表達量開始因受到真空的抑制作用而下降，這與POD活性變化及蓮藕褐變程度相一致。常艷等通過研究發現，多酚氧化酶基因（PbPPO）是參與碭山酥梨品質變化的關鍵基因[35]。韓艷文等通過不同降溫方式處理采收后的鴨梨發現，與POD活性相關基因的表達與鴨梨的褐變度變化和品質變化有直接的聯系[36]。筆者所在實驗室在前期研究中發現，高溫下新鮮蓮藕褐變度的增加與NnPPOA、NnPOD1-6基因表達量的上調有關[19]。因此，筆者認為，NnPPOA/C和NnPOD1/2/3可能參與了真空包裝下鮮切蓮藕褐變延緩進程，是鮮切蓮藕褐變的重要候選基因。

3 結論

在4 ℃貯藏期內，真空包裝相對于常壓包裝能明顯降低鮮切蓮藕的褐變度，同時發現，真空包裝鮮切蓮藕的PPO活性均始終低于常壓包裝，POD活性在貯藏7 d后被抑制并逐步低于常壓包裝，這與2種包裝方式下蓮藕褐變度變化情況大體一致。此外，NnPPOA/C和NnPOD1/2/3/4受真空包裝影響均參與了PPO、POD活性變化的調控過程，且基因NnPPOC、NnPOD4的表達情況分別對PPO、POD活性的影響與最終蓮藕的褐變度變化相吻合。說明真空包裝可能通過下調NnPPOA/C和NnPOD1/2/3的表達量來延緩鮮切蓮藕褐變進程。

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