豬偽狂犬病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

溫書香 安利民 趙協

摘要：為建立一種快速、特異、鑒別診斷豬偽狂犬病毒野毒感染與疫苗免疫株，參考GenBank上公布的豬偽狂犬病毒gE基因序列設計了1對引物，以豬偽狂犬病毒核酸作為模板，PCR方法將擴增得到的核酸序列克隆到PEGM-18T載體上，將克隆載體轉化到DH5α感受態細胞中，測序鑒定陽性重組質粒作為標準品建立豬偽狂犬病毒熒光定量PCR檢測方法。結果表明，本研究所建立的豬偽狂犬病毒熒光定量PCR方法檢測靈敏度可達10拷貝，與藍耳病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒、豬圓環病毒不發生交叉反應，具有良好的特異性和可重復性。此外，對33份疑似豬偽狂犬病料也作了檢測，結果表明，2份病料均為陽性。本研究建立的豬偽狂犬病毒實時熒光定量PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好、不發生交叉反應等優點，可用于日常豬偽狂犬病毒野毒感染與疫苗免疫株的鑒別診斷。

關鍵詞：豬偽狂犬病毒;熒光定量PCR技術;靈敏度;標準曲線

中圖分類號： S858.285.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0050-04

豬偽狂犬病（PRV）是由稱豬皰疹病毒感染引起的一種高度接觸性、傳染性疾病。豬是本病的傳染源及自然宿主，本病的暴發常可引起妊娠母豬的流產率增高、仔豬的神經癥狀、公豬因睪丸炎喪失種用價值以及成年豬的呼吸系統疾病，每年給我國養豬業造成嚴重的經濟損失[1-3]。任何年齡段的豬感染PRV后均能形成潛伏感染，感染PRV的豬終身帶毒。在一定條件下PRV病毒可以被激活，引起隱性豬的復發性感染和散毒。因此，及時地診斷PRV是預防和控制該病的有效手段。在病原學診斷方法中，熒光定量PCR方法具有靈敏度高、特異性強、快速高通量等優點，廣泛應用于多種動物疫病的診斷[4]。本研究根據PRV病毒核酸設計了1對特異性引物，建立了一種快速鑒別診斷PRV病毒的熒光定量PCR方法，為河南省漯河市豬偽狂犬病的早期鑒別診斷和病毒分離提供了一種快速檢測和定性的方法，為后續豬偽狂犬病的凈化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 漯河市問十鄉一散養戶母豬存欄量24頭，其中初產母豬8頭，經產母豬16頭。2016年11月15日夜里該養豬場1頭經產母豬產仔15頭，2 d晚上有4頭仔豬表現體溫升高、食欲不振、精神萎靡、站立不穩等癥狀，3 d早上有5頭仔豬相繼死亡，另有5頭仔豬相繼發病并出現相似的臨床癥狀，1頭仔豬表現為典型的豬偽狂犬病臨床癥狀，犬臥姿勢、原地轉圈運動、叫聲嘶啞，隨后體溫下降很快死亡。根據臨床癥狀和剖檢結果判定為疑似豬偽狂犬病，對發病和死亡的仔豬進行無菌采血，并采集心臟、肝臟、腎臟、腦、脾臟等組織進行充分研磨，用于PRV病毒的鑒定。

1.1.2 毒株、試劑及儀器設備 本研究所用豬偽狂犬病毒細胞培養物，由河南省疫控中心贈送;豬偽狂犬病毒gE、gB抗體檢測試劑盒，購于美國IDEX公司;豬偽狂犬病毒gE基因實時熒光定量PCR檢測試劑盒，購自上海之江生物科技股份有限公司;SYBR Green熒光染料、PMD-18T載體、DH5α，均購自TaKaRa;2×Taq Mix、質粒提取試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司，14 mL搖菌管，購自美國BD公司。

1.1.3 儀器設備 酶標儀購自美國寶特公司，超低溫冰箱購自中科美菱，電熱恒溫水浴鍋購自上海樹立儀器儀表公司，PCR儀、電泳儀均購自美國伯樂，熒光定量PCR儀購自美國熱電公司，凝膠成像分析系統購自美國Protein Simple公司，臺式高速冷凍離心機購自德國艾本德股份公司（Eppendorf AG），掌上離心機購自美國賽洛捷克，生物安全柜購自上海力申。

1.1.4 引物設計及合成 從NCBI上下載7個豬偽狂犬病毒保守基因gE基因核酸序列，用DNAMAN軟件將以上7種序列進行比對，尋找突變率較低的區域用Primer 3在線軟件進行引物設計，用Oligo 6對設計的多對引物進行評價，最終選擇1對最優的引物作為本次熒光定量PCR方法建立所用引物（表1）。

1.2 方法

1.2.1 PRV gE抗體檢測結果的判定 將無菌采集的6份豬血清用PRV gE/gB抗體檢測試劑盒進行檢測，結果判定依據試劑盒說明書：S/N值≤0.5判為抗體陽性;0.5 1.2.2 PMD-gE質粒的構建 以PRV全毒為模板，采用“1.1.5”節的引物進行擴增，反應條件：95 ℃ 5 min預變性;95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30個循環;最后72 ℃ 延伸 10 min。反應結束后將PCR產物進行電泳和切膠回收，將回收產物與PMD18-T載體連接2 h并全部轉入DH5α細胞中，加入無氨芐抗性的LB液體培養基，180 r/min搖菌1 h，取100 μL涂布到含有氨芐抗性的LB固體培養基上，37 ℃溫箱過夜，挑取陽性單克隆菌落用PCR方法鑒定，并將鑒定為陽性的質粒送測序。將測序正確的質粒作為熒光定量PCR的重組質粒標準品，用Nanodrop測定質粒濃度并計算拷貝數，拷貝數=質粒濃度×6.02×1023/（660×質粒總長度）。

1.2.3 熒光定量PCR方法的建立和條件的優化 熒光定量PCR反應體系的組成：2×Mix 12.5 μL，PRV上下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，無菌蒸餾水6.5 μL，DNA 2.0 μL。反應條件為：95 ℃ 5 min預變性;95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30個循環;最后72 ℃ 總延伸10 min。根據以上反應條件，以PRV病毒株為模板，分別對引物濃度范圍（2.5～15.0 μmol/L）和退火溫度（52～60 ℃）進行優化。

1.2.4 標準曲線的建立 將構建的PRV陽性質粒用無菌蒸餾水先稀釋至1×108，再10倍系列稀釋7個梯度，并且以每個稀釋度的稀釋液為模板，進行熒光定量PCR反應，反應條件按照優化好的條件進行。

1.2.5 熒光定量PCR特異性檢測 將筆者所在實驗室購買的豬瘟、豬藍耳、豬圓環、口蹄疫病毒核酸連同豬偽狂犬病毒核酸，采用本研究所建立的診斷方法一同檢測，以驗證該方法的特異性。

1.2.6 重復性試驗 分別取1×106、1×104、1×102拷貝/μL 質粒進行3次批內和批間的重復試驗，計算本方法的變異系數，判定本檢測方法是否可重復。

1.2.7 臨床樣本的檢測 采用本研究所建立的PRV熒光定量PCR方法對6份豬偽狂犬病疑似病例進行檢測，所得結果與PRV檢測試劑盒進行對比，判定該方法是否能夠用于臨床樣本的檢測。

2 結果與分析

2.1 PRV gE/gB抗體檢測結果

本試驗將采集的6份仔豬血清做豬偽狂犬病毒抗體水平檢測，檢測結果見表2。由表2可知，發病豬場仔豬豬偽狂犬病gB抗體陽性數為0，gE抗體陽性數為6個。

2.2 引物擴增結果

使用設計好的引物，以PRV全病毒進行擴增，獲得約 200 bp 的核酸條帶（圖1），與預期結果相符合。

2.3 PMD18-T-gE陽性克隆的鑒定

用設計的引物對克隆的載體進行陽性鑒定，結果見圖2。由圖2可知，該引物成功克隆出約200 bp條帶，與預期結果一致。將PCR鑒定陽性的樣品進行測序，測序結果正確。

2.4 熒光定量PCR反應條件的確定

為選擇最優的熒光定量PCR反應條件，本研究同時設立在不同引物濃度和退火溫度的條件下進行擴增，結果見圖3。由圖3可知，當引物濃度為0.02 μmol/L、退火溫度為58 ℃時，電泳核酸條帶豐度最好，無非特異擴增。

2.5 熒光定量PCR標準曲線的建立

用含有目的片段質粒作為標準品，將標準品濃度為 109 拷貝/μL 的質粒進行10倍稀釋8個梯度，每個稀釋度的質粒作為模板進行熒光PCR擴增。由圖4、圖5可知，每個稀釋度的擴增曲線之間的距離均勻，標準曲線相關系數為3.42，R2值為0.998，擴增效率為102.426，每個稀釋度的3個重復之間的標準差為0.243，說明定量結果精密度高、重復性好，本研究所建立的標準曲線參數優越于標準的規定，可用于豬偽狂犬病的定量檢測。

2.6 熒光定量PCR方法的特異性和準確性

本研究將豬瘟、豬藍耳、豬圓環、口蹄疫和豬偽狂犬病毒核酸作為模板進行熒光PCR擴增，結果顯示，除了豬偽狂犬病毒外，其余病毒的擴增曲線均為直線且在基線以下，豬偽狂犬病毒的擴增曲線為典型的S形（圖6、圖7）。說明本研究所建立的熒光PCR檢測方法具有良好的特異性和準確性。

2.7 熒光PCR檢測方法的重復性和穩定性

分別抽取1×106、1×104、1×102拷貝/μL質粒進行3次批內和批間的重復試驗，由表3可知，每個梯度的最終實測值數量級不變，常數在0.99～1.01之間，對應的CTsd值和變異系數見表3，同一批次3個濃度梯度3次重復試驗的CT值變異系數<5%，說明本研究所建立的熒光PCR檢測方法重復性好、穩定性高。

2.8 熒光PCR檢測方法的靈敏度

由圖8可知，擴增曲線各個稀釋度間距均勻，線性范圍在100～109 拷貝/μL，所建立的標準曲線斜率為-3.243，標準曲線的R2為0.998，擴增效率為102.426，當標準品的稀釋度達到1×101 拷貝/μL時認可以看到明顯的擴增曲線，對應的CT為2.46個，當標準品的稀釋度達到1×100 拷貝/μL 時，仍有擴增曲線，CT為35.43個，拷貝數為2.158拷貝，已超出可信范圍，所以本研究所建立的熒光PCR檢測方法最低檢測范圍為10拷貝/μL。

2.9 熒光PCR檢測方法的應用

本研究用所建立的熒光PCR檢測方法對將從門診和豬場采集的35份疑似豬偽狂犬病病料進行檢測。其中標準品擴增曲線的斜率為-3.18，R2為0.996，擴增效率為101.273。對檢測結果進行分析發現，有2份樣品的CT和拷貝數均在檢測限內，判定為陽性，其他33份樣品的CT超出檢測限，或者拷貝數小于10拷貝，或者兩者均在檢測限外，判定為陰性。與此同時，筆者用上海之江和洛陽萊普生公司生產的試劑盒作對比，發現三者之間的符合率達到100%。3 討論與結論

實時熒光定量PCR技術是在傳統PCR技術的基礎上發展起來的一種靈敏度高、特異性強、反應時間短、定量準確的檢測技術，它克服傳統PCR假陽性高和定量不準確等缺點，已成為病原學檢測中重要的方法[5-6]。本研究所建立的熒光PCR檢測方法能夠實現對豬偽狂犬病毒的定量檢測。相關研究表明，熒光定量PCR擴增產物多在100～200 bp，一般不超過300 bp[7]，本研究設計的引物擴增片段大小為165 bp，擴增片段適中，有利于提高該檢測方法的效率。本研究所建立的熒光PCR方法以構建的重組質粒為標準品，將標準品進行梯度稀釋，每個梯度間的間距均勻，標準曲線R2值均在0.99以上，擴增效率在90%～110%之間，說明所測結果的準確性較高。此外，對建立的熒光檢測方法進行靈敏性、特異性和重復性試驗，結果顯示，本研究建立的檢測方法靈敏度可以達到10拷貝/μL;對豬瘟、豬藍耳、豬圓環、口蹄疫等病毒均無交叉反應現象，充分證明了該檢測方法具有良好的特異性;不同稀釋度的模板進行批內和批間試驗，其CT值變異系數均不超過5%，說明其重復性比較好。用本研究建立的熒光PCR檢測方法和購買的2個商家試劑盒對臨床35份樣本同時進行檢測，發現3種檢測結果的符合率為100%。本研究所建立的豬偽狂犬病熒光定量PCR方法為規模化豬場豬偽狂犬病的快速檢測奠定了基礎，為筆者所在實驗室病原學檢測標準的制定提供了參考依據。

參考文獻：

[1]Liu H，Li X T，Hu B，et al. Outbreak of severe pseudorabies virus infection in pig-offal-fed farmed mink in Liaoning Province，China[J]. Archives of Virology，2017，162（3）：863-866.

[2]Wu C Y，Wu C W，Liao C M，et al. Enhancing expression of the pseudorabies virus glycoprotein E in yeast and its application in an indirect sandwich ELISA[J]. Journal of Applied Microbiology，2017，123（3）：594-601.

[3]華利忠，劉劍鋒，馮志新，等. 豬偽狂犬病病毒新流行變異毒株的研究進展[J]. 江蘇農業學報，2017，33（2）：476-480.

[4]龔雙燕，李小璟，李幽幽，等. 豬傳染性胃腸炎病毒SYBRGreenⅡ熒光定量PCR檢測方法的建立及在初乳檢測上的應用[J]. 江蘇農業學報，2017，33（5）：1076-1081.

[5]Kong X D，Li L，Sun L，et al. Rapid diagnosis of aneuploidy using segmental duplication quantitative fluorescent PCR[J]. PLoS One，2014，9（3）：e88932.

[6]Fei B Y，Lv H X，Zheng W H. Fluorescent quantitative PCR of Mycobacterium tuberculosis for differentiating intestinal tuberculosis from Crohns disease[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research，2014，47（2）：166-170.

[7]Leifer I，Blome S，Beer M，et al. Development of a highly sensitive real-time RT-PCR protocol for the detection of classical swine fever virus Independent of the 5′ untranslated region[J]. Journal of Virological Methods，2011，171（1）：314-317.王學林，柳 軍，黃琴琴，等. 基于模糊數學的安徽雙季早稻生長季氣候適宜性評價[J]. 江蘇農業科學，2019，47（7）：54-60.