H9N2亞型AIV雙重RT-PCR檢測方法的建立

司振書 殷國政 路建彪

摘要：為H9N2亞型AIV進行快速、準確鑒定與診斷，根據H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因各設計1對引物，建立了一種對2個表面基因同時進行擴增的雙重RT-PCR檢測方法。HA、NA基因預期擴增的目的片段長度分別為700、423 bp。通過對H9N2亞型禽流感病毒不同稀釋度的尿囊液進行檢測，證實病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL。采用該方法對H1～H15和N1～N9等亞型流感病毒及新城疫病毒等進行檢測，結果只有H9N2亞型AIV出現2個特異性目的條帶，與其他常見禽病病原無交叉反應;用建立的雙重RT-PCR和病毒分離2種方法同時對送檢樣品進行檢測，結果2種方法的符合率達99.77%，說明該檢測方法特異性強、敏感性較高，在臨床診斷和流行病學調查方面具有較好的應用前景。

關鍵詞：禽流感病毒;H9N2亞型;雙重RT-PCR;檢測方法

中圖分類號： S852.65+7 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0035-03

H9N2亞型禽流感病毒為中低致病力毒株，分布廣泛，司振書等對山東省雞群進行了H9亞型AIV的感染情況進行了調查，疑似流感病雞病料RT-PCR陽性率為8.41%[1]。該病毒能造成雞群的免疫抑制，如果與其他病原協同感染則可引起禽類嚴重發病，如與金黃色葡萄球菌混合感染可引起肉雞發病，死亡率達6%[2]。2013年，我國發生了H7N9感染人事件，6個內部基因全部來自于H9N2 AIV[3-4]，1999年來發生了多次H9N2亞型AIV感染人的事件[5]，給人類健康帶來威脅。禽流感病毒有多種檢測方法，包括血凝（HA）、血凝抑制（HI）試驗，神經氨酸酶抑制（NI）試驗，瓊脂擴散試驗（AGP），酶聯免疫吸附試驗（ELISA），病毒的中和試驗（NT），免疫熒光抗體技術（IFA）和real-time RT-PCR等。司振書等建立了針對H9亞型AIV的RT-PCR檢測方法[6]，包紅梅等建立了一步法RT-PCR檢測方法，具有較好地特異性和敏感性[7]，但以上方法沒有對NA基因進行擴增，不能確定NA亞型。司振書等對H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因分別進行擴增，操作較麻煩且多耗試驗材料[8]。傳統的血清學方法則需要多種亞型的血清和抗原，費時費力。根據H9N2亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因各設計1對引物，初步建立了一種針對H9N2亞型AIV的雙重RT-PCR檢測方法，該方法特異性強、敏感性較高。該試驗于2012年在中國農業大學動物流感研究室完成。

1 材料與方法

1.1 毒株

H9N2亞型AIV標準參考毒株、H1～H15亞型AIV、N1-N9 亞型AIV、雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、馬立克氏病病毒及雞痘病毒等毒株，由中國農業大學動物流感研究室保存并提供。

1.2 引物的設計、合成與篩選

針對HA、NA基因的保守區序列分別設計特異性引物，用Oligo 4.0軟件分析上下游引物是否匹配，將分析合格的引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司北京合成部合成。分別合成了針對HA、NA基因的5對引物，用H9N2亞型AIV進行篩選，根據擴增效率確定的引物對見表1。HA、NA基因擴增的目的片段長度分別為700、423 bp。

1.3 主要試劑

TRIzol Reagent，由Invitrogen公司生產;反轉錄試劑盒K1622，Fermentas;三氯甲烷、異丙醇、乙醇等均為市售;T4連接酶，由Promega公司生產;GoldenView、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，由北京索萊寶公司生產;Trans5K DNA Marker、DL2000DNA Marker、DH5α感受態細胞，由北京全式金生物技術有限公司生產;PMD-18T載體，由TaKaRa公司生產。

1.4 H9N2亞型AIV病毒含量的測定

取感染H9N2亞型禽流感病毒A/雞/山東/ZB/2007的尿囊液，作10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種3枚雞胚，0.1 mL/枚。35 ℃孵育48 h，將雞胚于4 ℃過夜，收獲尿囊液，測定其血凝效價，按Reed-Muench法公式計算半數感染量。

1.5 病毒RNA的提取

Trizol法提取毒株A/Chicken/Shandong/ZB/2007和A/Chicken/Shandong/6/96的RNA，立即作RT-PCR的擴增或-80 ℃保存備用。

1.6 cDNA的合成

按試劑盒說明書進行。

1.7 雙重RT-PCR反應體系和反應條件的優化

對雙重RT-PCR的反應體系和變性、退火、延伸溫度和時間、循環次數等反應條件進行優化。最后確定采用總體積為25 μL的反應體系：2×PCR mix buffer12.5 μL;濃度為 20 pmol/μL HA上游引物H9-F 1.0 μL;HA下游引物H9-R 1.0 μL;濃度為20 pmol/μL NA上游引物N2-F 1.5 μL;NA下游引物N2-R 1.5 μL;ddH2O補足至25.0 μL。最后確定雙重RT-PCR最佳循環條件為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，48 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，34個循環;72 ℃延伸10 min。

1.8 雙重RT-PCR特異性試驗

用建立的雙重RT-PCR方法分別對H1～H15亞型AIV、N1-N9亞型AIV進行檢測，以檢測其他亞型病毒是否存在假陽性，即是否與其他亞型AIV具有交叉反應;用該方法對雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、馬立克氏病病毒及雞痘病毒等毒株進行檢測，分析該雙重RT-PCR檢測方法的特異性。

1.9 雙重RT-PCR敏感性試驗

對已確定病毒含量的毒株A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液進行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀釋度稀釋，對不同稀釋度尿囊液進行檢測以確定其敏感性。

1.10 雙重RT-PCR的應用

對送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品用雙重RT-PCR和病毒分離2種方法檢測，以檢測2種方法的符合率。

2 結果與分析

2.1 病毒含量的測定結果

經測定H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液，病毒含量為1×107.25 EID50/100 μL。

2.2 H9、N2雙重RT-PCR擴增結果

H9N2亞型AIV A/Chicken/Shandong/ZB/2007和A/Chicken/Shandong/6/96的雙重RT-PCR擴增結果見圖1，均獲得700、423 bp的目的片段。

2.3 特異性試驗結果

對H1～H15亞型AIV（其中H9 AIV為H9N2亞型）進行雙重RT-PCR檢測，H9N2亞型AIV擴增出700、423 bp的2個目的條帶，其他亞型病毒均沒有擴增出目的條帶（圖2）。對N1～N9等其他亞型（其中N2 AIV為H9N2亞型）AIV進行檢測，H9N2亞型AIV擴增出700、423 bp的目的條帶，其他亞型病毒均未出現條帶（圖3）。對NDV、IBV等其他病毒進行檢測（圖4）。H9N2亞型AIV擴增出700、423 bp的2個目的條帶，而NDV、IBV等均無條帶產生。結果表明，所建立的雙重RT-PCR檢測方法具有很強的特異性，可以特異性地檢出H9N2亞型禽流感病毒。

2.4 敏感性試驗結果

對不同稀釋度的病毒液分別進行檢測（圖5）。在10-3稀釋時，仍然可以擴增出2個明顯的目的條帶，說明該方法對病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL，靈敏度較高、敏感性較強。

2.5 雙重RT-PCR的應用

用建立的雙重RT-PCR和病毒分離與血清學鑒定2種方法，同時對送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品進行檢測，結果2種檢測方法的符合率達 99.77%（表1）。

3 討論

H9N2亞型AIV在我國雞群中分布廣泛，并能引起人類感染，給養禽業和公共衛生造成重大影響，因此對其快速準確地鑒定非常重要。RT-PCR診斷技術可從基因水平檢測AIV，具有較高的特異性和敏感性。建立的雙重RT-PCR檢測方法對H1～H15、N1～N9等亞型流感病毒，新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒等進行檢測，只有H9N2亞型AIV出現2個特異性目的條帶，其他亞型AIV與NDV等無任何條帶，說明該方法對其他亞型AIV及NDV等無交叉反應，具有特異性;通過對不同稀釋度的H9N2亞型AIV進行檢測，證實病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL，說明該檢測方法敏感性較高;對送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品進行檢測，其結果與經典的病毒分離與血清學鑒定符合率達99.77%。

該方法H9、N2基因擴增所產生的目的條帶分別為700、423 bp，相比而言，700 bp的條帶更亮，而長度為423 bp的條帶較暗，盡管對各引物濃度、模板用量、退火溫度等因素進行了多次試驗，反復優化，擴增片段仍然一明一暗，短的片段雖相比暗些，但條帶明顯，不影響結果的判斷。建立的雙重 RT-PCR 方法可對H9N2亞型AIV進行快速鑒定，該方法的建立為進一步進行試劑盒的研制打下了良好的基礎，在臨床診斷和流行病學調查方面具有較好的應用前景。

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