微生物莽草酸代謝途徑的研究進展

陳園 趙淑娟

摘要：莽草酸是莽草酸代謝途徑的中間產(chǎn)物，是合成手型藥物的關鍵原料，也是合成芳香族類氨基酸（L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸）、泛醌、葉酸、維生素K2等芳香族化合物的關鍵中間體。通過基因改造微生物莽草酸代謝途徑，可以使其大量積累莽草酸，進而為生物體內(nèi)合成芳香族氨基酸奠定基礎。本文綜述了莽草酸代謝途徑在重組大腸桿菌中的生物合成途徑的研究進展，分析了莽草酸合成過程中關鍵酶基因改造對莽草酸積累的影響、輔因子再生對目的產(chǎn)物的影響，還討論了減少莽草酸工程菌代謝副產(chǎn)物產(chǎn)生量的措施。隨著代謝工程技術和合成生物學技術的發(fā)展，通過基因技術定向改造代謝途徑，構建理想的高產(chǎn)菌株已經(jīng)成為研究的新熱點。

關鍵詞：莽草酸代謝途徑;基因改造;關鍵酶基因;輔因子

中圖分類號： Q945.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0019-05

莽草酸及其衍生物具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌抗炎、抗血栓及抗腦缺血等多種藥理活性。近年來，莽草酸作為臨床上對抗禽流感的唯一有效藥物達菲（主要成分為磷酸奧司他韋）的合成前體而倍受關注[1]。莽草酸途徑廣泛存在于植物、細菌等微生物中[2-5]。目前，莽草酸的工業(yè)化生產(chǎn)方式主要有2種：（1）從八角茴香的果實中提取[6];（2）通過化學合成的方式人工合成莽草酸[7]。從八角茴香中提取莽草酸，由于受到植物生長季節(jié)、生長周期、地域環(huán)境的限制，從而嚴重制約了莽草酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn);化學合成法由于生產(chǎn)工藝復雜、成本高、純度不高等因素，也嚴重限制了莽草酸的規(guī)模化生產(chǎn)。利用微生物工程菌合成莽草酸，在生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)工藝與生產(chǎn)周期等方面具有顯著優(yōu)勢，因此成為國內(nèi)外很多醫(yī)藥公司與實驗室研究的熱點。目前已報道的莽草酸基因工程菌主要有大腸桿菌（Escherichia coli）[8]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[9]、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）[10-11]、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）[12-15]以及巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[16]等。

1 微生物生產(chǎn)莽草酸的研究進展

目前，利用微生物生物轉(zhuǎn)化合成莽草酸的研究進展迅速，相關報道顯示，目前工程菌株產(chǎn)莽草酸的最高產(chǎn)量達到 84 g/L。近幾年來研究者構建的莽草酸工程菌株及其功能、產(chǎn)量等信息見表1。

2 莽草酸途徑概述

莽草酸途徑（shikimic acid pathway）是以磷酸烯醇式丙酮酸、赤蘚糖-4-磷酸為起始底物，在生物體內(nèi)經(jīng)過一系列催化酶的催化作用生成莽草酸，然后再以莽草酸為中間化合物合成一系列芳香族類化合物，如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等的過程。生物細胞以葡萄糖為初始底物，在經(jīng)過糖酵解途徑合成磷酸烯醇式丙酮酸的同時，通過戊糖磷酸途徑合成赤蘚糖-4-磷酸。生物體內(nèi)的莽草酸途徑以磷酸烯醇式丙酮酸與赤蘚 糖-4-磷酸為起始化合物，在3-脫氧-阿拉伯庚酮糖-7- 磷酸（3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate，簡稱DAHP）合成酶的作用下縮合形成3-脫氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸。DAHP經(jīng)過3-脫氫奎尼酸（3-dehydroquinic acid，簡稱DHQ）合酶的催化作用生成3-脫氫奎尼酸，DHQ在3-脫氫奎尼酸脫水酶的作用下生成3-脫氫莽草酸（3-dehydroshikimic acid，簡稱DHS）。DHS在莽草酸脫氫酶的作用下生成莽草酸（shikimic acid，簡稱SA）。莽草酸經(jīng)莽草酸激酶催化生成莽草酸-3-磷酸（shikimate-3-phosphate，簡稱S3P）。隨后，在一系列酶的催化下，經(jīng)過分支酸（chorismic acid，簡稱CHA）分別轉(zhuǎn)化為芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸[24]。微生物細胞內(nèi)的莽草酸代謝途徑如圖1所示[25]。

3 關鍵酶基因的過表達

通過質(zhì)粒強化表達莽草酸代謝途徑的限速酶基因，可以增強莽草酸代謝途徑中的碳代謝流[17]。大腸桿菌莽草酸代謝途徑中的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，簡稱DAHP）合酶（aroG、aroF、aroH為DAHP的3個同功異構酶）、3-脫氫奎尼酸合成酶（aroB）和莽草酸脫氫酶（aroE）是莽草酸代謝途徑中的關鍵酶。DAHP合酶是由aroG、aroF和aroH基因編碼的同工酶，分別受到芳香族類氨基酸L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸的反饋抑制。通過定點突變、隨機誘變與突變株篩選等方法可以獲取抗反饋抑制的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶。為了解除終產(chǎn)物酪氨酸對aroG基因的反饋抑制，需要將其第146位氨基酸殘基天冬氨酸替換為天冬酰胺，能夠解除酪氨酸對aroG基因的反饋抑制，用亮氨酸殘基替換DAHP合酶同工酶aroF的第148位氨基酸殘基脯氨酸時，得到的突變菌株不受終產(chǎn)物苯丙氨酸的反饋抑制。因此，可以通過質(zhì)粒表達或基因重組等方式過表達對酪氨酸反饋抑制不敏感的aroGfbr基因與對苯丙氨酸不敏感的aroFfbr基因，提高莽草酸代謝途徑的碳代謝流。Draths等在莽草酸激酶完全缺失的大腸桿菌體內(nèi)過表達aroFfbr基因，同時通過質(zhì)粒過表達3-脫氫奎尼酸合成酶與莽草酸合成酶基因補料分批發(fā)酵培養(yǎng)42 h，使得莽草酸的產(chǎn)量達到27.2 g/L[26]。將這3個關鍵酶基因通過多個質(zhì)粒或者1個共表達載體進行過表達，已經(jīng)成為一套成熟的莽草酸工程菌改造策略。編碼3-脫氫奎尼酸合成酶的基因aroB與抗反饋抑制的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因共表達，可以增強3-脫氫奎尼酸合成酶的活性，減少DAHP的過度積累，增強莽草酸代謝途徑的碳代謝流。

4 中心代謝途徑的改造

在微生物體內(nèi)，葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑合成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤蘚糖-4-磷酸（E4P），PEP與E4P構成莽草酸代謝途徑的起始物。因此，通過對中心代謝途徑進行遺傳改造，加強前體PEP與E4P的供應量，可以強化莽草酸代謝途徑的碳流量。在非磷酸烯醇式丙酮酸：碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（簡稱PTS系統(tǒng)）的半乳糖透性酶（GalP）、半乳糖激酶（Galk）協(xié)同作用途徑中以腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）作為磷酸基團供體，不消耗PEP[8]。有研究表明，在 PTS+ 與PTS-Glc+中進入EMP和PPP途徑的碳代謝流分別為766%、223%和93.1%、5.3%，表明PTS-galP+glk+ 能夠促進EMP（糖酵解途徑）中PEP的合成，提高莽草酸代謝途徑中的碳流量。PTS系統(tǒng)中的EIIAGlc擁有碳代謝阻遏效應（carbon catabolic repression，簡稱CCR）的活性中心，可以阻遏細胞對葡萄糖以外其他碳源的利用分解，PTS-系統(tǒng)能夠遏制CCR，使細胞能夠充分利用多種碳源，強化莽草酸代謝途徑的碳流量。

在細菌內(nèi)，葡萄糖也可通過半乳糖透性酶介導的活性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，同時需要葡萄糖激酶蛋白Glk（由glk編碼）對細胞內(nèi)的葡萄糖進行磷酸化。因此，可以在PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)缺陷型菌株內(nèi)加強表達GalP、Glk蛋白，以實現(xiàn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運功能。Yi等在PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)缺失的大腸桿菌體內(nèi)通過質(zhì)粒表達來自運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）的葡萄糖易化體蛋白（glucose facilitator，簡稱Glf），結果顯示，表達Glk、Glf的PTS缺陷型菌株經(jīng)過48 h發(fā)酵培養(yǎng)，3-脫氫莽草酸的產(chǎn)量為60 g/L，與此同時，表達GalP、Glk的PTS缺陷型菌株經(jīng)過60 h發(fā)酵培養(yǎng)，3-脫氫莽草酸的產(chǎn)量也為60 g/L，說明Glf系統(tǒng)也是一種比較有效的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[27]。Chandran等在PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)缺陷型宿主菌體內(nèi)通過質(zhì)粒表達來自Zymomonas mobilis的葡萄糖易化體蛋白Glf與葡萄糖激酶蛋白Glk，同時解除DAHP合成酶的反饋抑制調(diào)節(jié)，過表達關鍵酶基因磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（phosphoenolpyruvate synthase，簡稱ppsA），結果顯示，在添加10 L酵母提取物的發(fā)酵罐中，莽草酸的產(chǎn)量達到了87 g/L，莽草酸的得率為33%[21]。

4.1 PTS系統(tǒng)的改造

磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)是大腸桿菌在細胞內(nèi)參與葡萄糖從膜間質(zhì)轉(zhuǎn)運和磷酸化到細胞內(nèi)的主要活性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基內(nèi)，PTS系統(tǒng)消耗了大約50%的磷酸烯醇式丙酮酸，而磷酸烯醇式丙酮酸是莽草酸代謝途徑的起始物質(zhì)，因此，合理改造PTS系統(tǒng)有利于提高莽草酸代謝途徑前體PEP的利用率，從而提高莽草酸代謝途徑的碳流量。Chandran等將運動發(fā)酵單胞菌來源的、以ATP作為磷酸基團供體的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)以質(zhì)粒方式轉(zhuǎn)化到PTS系統(tǒng)缺失的大腸桿菌內(nèi)，同時過表達tktA基因以補料分批發(fā)酵培養(yǎng)，結果表明，莽草酸的產(chǎn)率達到 0.33 mol/mol（以單位量的葡萄糖產(chǎn)莽草酸的量計，下同），產(chǎn)量為84 g/L;同時，對于未進行PTS改造的菌株，同樣采用補料分批發(fā)酵培養(yǎng)的莽草酸的積累量為62 g/L[21]。

4.2 增加莽草酸途徑起始底物E4P的濃度

大量研究表明，過量表達DAHP合成酶并不能無限制地提高莽草酸代謝途徑中的碳代謝流，必須同時加強表達tktA基因編碼的轉(zhuǎn)酮醇酶A，以增加磷酸戊糖途徑中赤蘚糖-4-磷酸的供應量，進而增加莽草酸代謝途徑中的碳代謝流。Knop等在大腸桿菌體內(nèi)過表達tktA基因后，莽草酸產(chǎn)量由 38 g/L 提高到52 g/L，莽草酸的產(chǎn)率由0.12 mol/mol上升到0.18 mol/mol[6]。有研究者在aroL、aroK雙基因敲除菌株W3110（ΔaroLΔaroK）中轉(zhuǎn)入含有莽草酸代謝途徑中關鍵基因aroF、aroE、aroB、ppsA以及tktA基因的重組表達質(zhì)粒pSUFEBPT，用補料分批發(fā)酵的方式發(fā)酵培養(yǎng)128 h，結果顯示，莽草酸的產(chǎn)量達到39.3 g/L。

5 降低副產(chǎn)物的產(chǎn)量

莽草酸代謝途徑中存在多步分支途徑與可逆反應，代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物奎尼酸（quinic acid，簡稱QA）和3-脫氫莽草酸對于細胞的生長有強烈的抑制作用，同時能夠競爭性消耗碳源，從而嚴重降低莽草酸的產(chǎn)率與純度。Knop等構建的大腸桿菌菌株SP1.1/pKD12.112發(fā)酵42 h，能夠產(chǎn)生27.2 g/L莽草酸，但是副產(chǎn)物奎尼酸、3-脫氫莽草酸的產(chǎn)量分別有12.6、4.4 g/L，副產(chǎn)物的積累減少了莽草酸的含量與純度，從而影響下游代謝反應[6]。YdiB是一種雙功能酶，具有脫氫奎尼酸脫氫酶（aroD基因產(chǎn)物）和莽草酸脫氫酶（aroE基因產(chǎn)物）的雙重功能，ydiB基因缺失后，奎尼酸合成受到限制，3-脫氫奎尼酸能夠積累并且在脫氫奎尼酸脫水酶的催化下經(jīng)過3-脫氫莽草酸合成莽草酸。Chen等在ydiB基因完全缺失的大腸桿菌SA4中過量表達莽草酸脫氫酶基因，以減少代謝流中3-脫氫奎尼酸向奎尼酸的轉(zhuǎn)化，促進3-脫氫莽草酸的積累，進而促進莽草酸的生物合成[20]。有研究者將 1 mmol/L 甲基-α-D-葡萄糖吡喃糖苷加到葡萄糖限制性培養(yǎng)基中作為碳源，經(jīng)過48 h的發(fā)酵培養(yǎng)，副產(chǎn)物奎尼酸的產(chǎn)量由 19 g/L 減少到2.8 g/L，目的產(chǎn)物莽草酸的產(chǎn)量從原來的 28 g/L 升高到35 g/L，莽草酸的產(chǎn)率由15%上升至19%。該研究表明，以1 mmol/L甲基-α-D-葡萄糖吡喃糖苷作為碳源可以明顯提高莽草酸的合成量，同時減少副產(chǎn)物奎尼酸的產(chǎn)生[6]。在煙草中，存在同時具有3-脫氫奎尼酸脫水酶（aroD）和莽草酸脫氫酶（aroE）催化活性的雙功能酶，由aroD*E基因編碼。將煙草來源的aroD*E基因?qū)隺roD、aroE基因同時被敲除的重組菌中，經(jīng)過66 h的發(fā)酵培養(yǎng)，莽草酸的產(chǎn)量達到34 g/L，產(chǎn)率達到15%。發(fā)酵液中莽草酸、奎尼酸、3-脫氫莽草酸的物質(zhì)的量的比為 29 ∶ 1.0 ∶ 5.7，可見副產(chǎn)物奎尼酸的產(chǎn)量明顯減少。

6 輔因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的表達

輔因子是一類能夠使底物與酶活性部位結合或者使酶更具有活性的金屬離子或輔酶。有些氧化還原酶催化的反應是需要以還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、NADPH為輔酶的，氧化還原力的不平衡，不僅會影響細胞的連續(xù)生長、目的產(chǎn)物的合成，還會導致代謝碳流從需要生成的目的產(chǎn)物的代謝途徑流轉(zhuǎn)向其他途徑而產(chǎn)生副產(chǎn)物。因此，控制輔因子的生物合成供應對于進一步提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量非常重要[28-29]。研究表明，維持NADPH的可用濃度可以提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。Kabus等在谷氨酸棒狀桿菌體內(nèi)過表達來自大腸桿菌的轉(zhuǎn)氫酶基因pntAB發(fā)現(xiàn)，在以葡萄糖為碳源的基本培養(yǎng)基中經(jīng)過72 h的發(fā)酵培養(yǎng)，賴氨酸的濃度從474 mmol/L升高到了522 mmol/L[30]。在莽草酸代謝途徑中，莽草酸脫氫酶需要NADPH輔因子的作用才能催化 3- 脫氫莽草酸轉(zhuǎn)化為莽草酸。目前，多數(shù)莽草酸工程菌的構建都會過表達關鍵酶基因aroE，這樣就會出現(xiàn)NADPH的還原力供應不足。在大腸桿菌體內(nèi)，轉(zhuǎn)氫酶（membrane-bound transhydrogenase，簡稱PntAB）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）激酶（NAD kinase，簡稱NADK）可以催化NADH與NADPH之間相互轉(zhuǎn)化，因此可以強化基因pntAB、nadK的表達，緩解還原力不平衡的問題。Cui等對NADPH對莽草酸途徑中莽草酸產(chǎn)量的影響進行研究，他們將pntAB、nadK基因分別整合到大腸桿菌染色體中，以增加細胞內(nèi)NADPH的供應量，搖瓶培養(yǎng)結果顯示，整合nadK基因后的重組菌SA116產(chǎn)率達到33%，產(chǎn)量為3.12 g/L[31]。對于戊糖磷酸途徑，可以過表達戊糖磷酸途徑中的NADPH代謝關鍵酶，例如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase，由zwf基因編碼）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，由gnd基因編碼）。Rodriguez等敲除大腸桿菌的PTS系統(tǒng)和pykF基因，同時過表達aroGfrb、aroE、aroB、aroD、tktA和zwf基因，分批發(fā)酵結果顯示，重組工程菌AR36產(chǎn)生莽草酸的終濃度為43.4 g/L，產(chǎn)率為42%[23]，這是目前研究莽草酸工程菌株中獲得的最高產(chǎn)率。

7 引導代謝平衡的模塊優(yōu)化策略

莽草酸途徑是一個較為復雜的代謝途徑，有研究發(fā)現(xiàn)，通過過量表達上游代謝途徑關鍵酶基因而使上游代謝碳流急劇增加時，由于下游代謝途徑無法正常消耗強大的上游碳代謝流，會造成中間產(chǎn)物的過量積累，過量存在的中間產(chǎn)物會對細胞內(nèi)的代謝途徑產(chǎn)生反饋抑制，或者產(chǎn)生細胞生長不需要的副產(chǎn)物，從而影響菌體的正常生長。因此，Wu等引入了模塊化代謝工程改造理論，系統(tǒng)改造各個模塊的碳代謝流量，以期找到一條最優(yōu)的途徑平衡方式，使代謝流更多地從可再生的廉價底物流向高附加值的目的化合物;Wu等引入模塊化代謝工程改造理論優(yōu)化黃酮骨架物質(zhì)的合成途徑，首先將總途徑分為4個模塊，通過系統(tǒng)改變各個模塊的代謝通量來尋找途徑中的瓶頸步驟，通過4個不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒和2個不同強度的啟動子來改變模塊的代謝通量以平衡合成途徑，經(jīng)過多輪模塊優(yōu)化后，生松素、柚皮素的產(chǎn)量分別提高至84.2、105.1 mg/L[32]。Zhang等在C. glutamicum中引入來源于古細菌Mcc. maripaludis和Msc. mazei的DKFP（6-deoxy-5-ketofructose 1-phosphate，即6-脫氧-5-酮果糖1-磷酸）途徑基因，以1個丙酮酸合酶基因、2個DKFP合酶基因、2個ADTH合酶基因、1個DHQ合酶基因為元件，通過不同組合方式組裝了3組模塊，結果表明，同時表達異源莽草酸代謝途徑與自身莽草酸代謝途徑的重組谷氨酸棒狀桿菌RES167ΔaroK/pDKFP-3比沒有導入異源代謝途徑的原始菌株RES167ΔaroK的莽草酸產(chǎn)量提高了57%，莽草酸產(chǎn)量從0.77 g/L提高到了1.20 g/L[11]。研究者從合成生物學的角度出發(fā)，通過一系列代謝途徑優(yōu)化、基因元件篩選與模塊組合，完成了對莽草酸代謝途徑的異源裝配，進一步對莽草酸代謝途徑模塊優(yōu)化策略實施了驗證。

8 總結與展望

通過對莽草酸代謝途徑的改造，包括解除莽草酸代謝途徑中的反饋抑制、過表達莽草酸代謝途徑中的關鍵酶基因、代謝途徑中NADPH輔因子再生等，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過遺傳改造的基因工程菌株合成莽草酸的產(chǎn)量有明顯提升。莽草酸是合成芳香族類氨基酸（L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸）的重要前體化合物，同時因其自身的藥用價值，具有廣闊的市場前景與經(jīng)濟價值。以葡萄糖為起始合成原料，通過基因改造工程菌生產(chǎn)莽草酸的方法，具有發(fā)酵周期短、可控性強、可持續(xù)性發(fā)展且對環(huán)境友好等特點，非常具有發(fā)展?jié)摿εc應用價值。盡管基因改造的工程菌較野生型的莽草酸發(fā)酵產(chǎn)量有所提高，但是仍然存在進一步提高的空間。今后的研究可以從以下幾個方面考慮：（1）通過定點突變解除DAHP合酶的反饋抑制后，可以通過多級質(zhì)譜或者核磁共振技術分析細胞全局的代謝流，從而找出細胞內(nèi)可能存在的其他限制性步驟。（2）通過基因過表達的方式提高了輔因子NADPH的供應量，進一步可以研究如何提高莽草酸代謝途徑中所需要的其他輔因子，例如ATP和丙二酰輔酶A等。（3）研究表明，以葡萄糖為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)，菌株生長較慢，但是莽草酸生產(chǎn)持續(xù)時間較長;以甘油為碳源時，菌株生長較快，但是莽草酸合成過早停止，因此可以嘗試葡萄糖結構類似物或者甘油結構類似物，觀察發(fā)酵結果是否能達到生產(chǎn)速率與持續(xù)生產(chǎn)時間的正相關。（4）可以考慮構建多種功能的菌株進行聯(lián)合培養(yǎng)發(fā)酵，例如構建特異性消耗副產(chǎn)物的菌株，與莽草酸菌株一起培養(yǎng)，以改善莽草酸生產(chǎn)菌株的生長環(huán)境，提高莽草酸的產(chǎn)量。

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