長方案IVF/ICSI周期中女性年齡和獲卵數對妊娠結局的影響

路紅琴，何玉潔

(山西醫科大學第一臨床醫學院生殖中心，太原 030001)

隨著生育年齡的推后，環境、壓力等因素的影響，我國不孕不育患者的數量已經超過400萬，占育齡人口的15%。隨著輔助生殖技術(ART)技術的發展，尤其是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及卵胞漿內單精子注射(ICSI)的日臻成熟，臨床妊娠率及活產率得到了很大的提高。目前，對于IVF/ICSI周期妊娠結局的研究大部分集中在獲卵數與臨床妊娠率、新鮮周期活產率等，而一次取卵周期獲卵數與累計活產率的相關性研究仍鮮見報道。本研究通過分析1 763例患者長方案獲卵周期的一般情況、實驗室指標及其新鮮移植活產率和累計活產率等病例資料，探討年齡與獲卵數對長方案IVF/ICSI臨床結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2011年7月至2016年7月期間在本院生殖科接受IVF/ICSI助孕治療的2 231例不孕患者的臨床資料。納入標準：(1)首次接受IVF/ICSI助孕；(2)采用GnRH-a黃體期長方案促排卵；(3)甲狀腺、腎上腺等未見明顯異常；(4)男方精液檢查根據世界衛生組織第5版男科精液常規檢查手冊標準檢查后可行IVF/ICSI。排除標準：(1)隨訪至今仍有未移植完胚胎的患者；(2)不成熟卵體外培養(IVM)、卵母細胞凍存者；(3)子宮畸形、宮腔粘連、子宮內膜異位癥、剖宮產以及存在內外科合并癥等；(4)囊胚移植、未獲卵、未受精、無可移植胚胎以及因各種原因未行胚胎移植者，減胎術后者。

二、研究方法

1.黃體期長方案：于黃體中期使用GnRH-a(達菲林，益普生，法國)1.25～1.88 mg降調節，月經周期第2～4天行相關檢查，當子宮厚度≤5 mm、血清FSH<5 U/L、黃體生成素(LH)<5 U/L、血清E2<183.5 pmol/L后開始使用促性腺激素(Gn)促排卵，經陰道超聲監測卵泡生長情況，當至少有1個卵泡直徑≥18 mm或2個卵泡直徑≥17 mm或 3個卵泡直徑≥16 mm時，當晚肌肉注射人HCG(珠海麗珠醫藥)6 000～10 000 U，36～38 h后在陰道超聲引導下穿刺取卵。

2.胚胎培養：取卵4 h后，行IVF/ ICSI，根據Gardner 6級評分法[1]評估胚胎質量。取卵后第3天移植2～3個胚胎，未被移植的可利用胚胎于移植當日行冷凍保存。有卵巢過度刺激綜合征(OHSS)風險或存在宮腔積液等不宜移植胚胎的情況時，則取消移植，冷凍所有胚胎。取卵當日開始給予黃體支持。

3.凍融胚胎移植(FET)：有冷凍胚胎者，新鮮周期失敗或有再生育指標時擇期行FET。采用自然周期或促排卵周期者于排卵當日開始肌肉注射黃體酮，排卵后3 d行胚胎移植；人工激素替代周期者給予雌激素促進內膜生長至8～9 mm時開始每日肌肉注射黃體酮40 mg，肌肉注射黃體酮第5天行胚胎移植。

4.移植結局隨訪：移植后14 d，檢測血清HCG水平，若陽性為生化妊娠；移植30 d后進行超聲檢查，見孕囊和胎心搏動者為臨床妊娠。活產定義為孕周滿28周，至少有1個存活新生兒分娩。單次取卵周期移植后獲得活產或移植完所有胚胎無活產為研究終點。

5.分組和評價指標：根據是否獲得活產將研究對象分為活產組和非活產組；根據助孕年齡不同分為<25歲、25～29歲、30～34歲、≥35歲4組；根據獲卵數不同分為≤5個、6～10個、11～15個、16～20個、≥21個5組。比較各組間的一般情況、實驗室指標、妊娠結局。

新鮮移植活產率=新鮮移植分娩活嬰周期數/新鮮移植周期數；累計活產率=該周期內所獲胚胎行新鮮移植或FET后獲得活嬰周期數/取卵周期數，表示以周期為單位的累積活嬰率。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料

研究共收集接受IVF助孕治療的不孕患者2 231例，經過數據篩選及排除后共納入研究1 763例患者(共1 763個周期)。

二、活產組與非活產組移植情況及妊娠結局的比較

1 763個取卵周期中分娩活嬰的1 036個周期，累計活產率58.76%，其中新鮮移植1 438個周期，541個周期分娩活嬰，新鮮移植活產率為37.62%。活產組與非活產組比較，活產組的年齡、不孕年限、基礎FSH(bFSH)、Gn使用總量顯著低于非活產組(P<0.05)；而HCG日血清E2水平、獲卵數、卵母細胞成熟率、受精率、可利用胚胎率、優質胚胎率均顯著高于非活產組(P<0.05)。兩組的Gn天數、HCG日內膜厚度比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

三、不同年齡組間移植情況及妊娠結局的比較

根據助孕年齡不同將入組研究對象分為<25歲(115例)、25～29歲(746例)、30～34歲(606例)、≥35歲(296例)4組。≥30歲患者的不孕年限顯著高于年齡<30歲者(P<0.05)；隨著年齡的增加所需Gn總量也顯著增加，年齡<25歲組的受精率最低，30～34歲組的可利用胚胎率最高(P均<0.05)；≥35歲組的不孕年限和bFSH水平顯著高于其他組，而≥35歲組的HCG日血清E2水平、獲卵數、優質胚胎率、新鮮移植活產率及累計活產率均顯著低于其他組(P均<0.05)。各年齡組間Gn天數、HCG日內膜厚度、卵母細胞成熟率的差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 活產組與非活產組移植情況及妊娠結局比較[(-±s)，%]

注：與活產組比較，*P<0.05；aGn規格：75 U/支

表2 不同年齡組間移植情況及妊娠結局的比較[(-±s)，%]

注：與<25歲組比較，*P<0.05；與25～29歲組比較，#P<0.05；與30～34歲組比較，$P<0.05

四、不同獲卵數組間移植情況及妊娠結局的比較

依據獲卵數不同將入組研究對象分為≤5個(160例)、6～10個(397例)、11～15個(421例)、16～20個(342例)、≥21個(443例)5組。獲卵數≤5個組的年齡、所需Gn總量顯著高于其他組，但HCG日血清E2水平顯著低于其他組(P<0.05)；獲卵數≥21個組的累計活產率顯著高于其他組，差異具有統計學意義(P<0.05)。各組間不孕年限、HCG日內膜厚度、卵母細胞成熟率、受精率、可利用胚胎率及優質胚胎率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)

五、不同年齡組中不同獲卵數組間移植情況及妊娠結局的比較

將不同年齡組的研究對象依據獲卵數的不同進一步分組。

1.<25歲組不同獲卵數組間移植情況及妊娠結局比較：獲卵數≤5個組的卵母細胞成熟率顯著低于其他組(P<0.05)；累計活產率隨著獲卵數的增加而增加，獲卵數≥21個組的累計活產率最高(P<0.05)。各組間年齡、不孕年限、bFSH、Gn天數、Gn總量、HCG日內膜厚度及血清E2水平、受精率、可利用胚胎率及新鮮移植活產率的差異均無統計學意義(P>0.05)(表4)。

表3 不同獲卵數組間移植情況及妊娠結局的比較[(-±s)，%]

注：與獲卵數≤5個組比較，*P<0.05；與6～10個組比較，#P<0.05；與11～15個組比較，$P<0.05；與16～20個組比較，&P<0.05

表4 <25歲組不同獲卵數組間移植情況及妊娠結局比較[(-±s)，%]

注：與獲卵數≤5個組比較，*P<0.05；與6～10個組比較，#P<0.05；與11～15個組比較，$P<0.05；與獲卵數16～20個組比較，&P<0.05

2.25～29歲組不同獲卵數組間移植情況及妊娠結局比較：獲卵數≥16個兩組的bFSH顯著低于獲卵數≤5個組(P<0.05)；獲卵數≤10個兩組的所需Gn總量顯著高于獲卵數≥16個兩組，但HCG日血清E2水平顯著低于獲卵數≥16個組(P<0.05)；獲卵數≥21個組的受精率顯著低于獲卵數6～10個組和獲卵數16～20個組(P<0.05)；累計活產率隨著獲卵數的增加而增加，獲卵數≥21個的累計活產率最高，與其他各組比較均有統計學差異(P<0.05)。各組間年齡、不孕年限、Gn天數、HCG日內膜厚度、卵母細胞成熟率、可利用胚胎率、優質胚胎率、新鮮移植活產率比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表5)。

表5 25～29歲組不同獲卵數組間移植情況及妊娠結局的比較[(-±s)，%]

注：與獲卵數≤5個組比較，*P<0.05；與6～10個組比較，#P<0.05；與11～15個組比較，$P<0.05；與16～20個組比較，&P<0.05

3.30～34歲組不同獲卵數間移植情況及妊娠結局的比較：獲卵數≤5個組的bFSH顯著高于其他組，HCG日血清E2水平隨獲卵數的增加而增加，≤5個組顯著低于其他組(P均<0.05)；獲卵數≤5個組所需Gn總量最多，獲卵數≥21個組最少(P均<0.05)；獲卵數6～10個組的卵母細胞成熟率顯著低于獲卵數≥16個兩組(P<0.05)；獲卵數11～15個組的新鮮移植活產率最高，顯著高于其他組(P<0.05)，獲卵數≥21組的新鮮移植活產率顯著高于獲卵數≤5個、6～10個、16～20個組(P<0.05)；累計活產率隨著獲卵數的增加而增加，獲卵數≥21個組的累計活產率最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。各組間年齡、不孕年限、Gn天數、HCG日內膜厚度、受精率、可利用胚胎率、優質胚胎率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表6)。

4.≥35歲組不同獲卵數間移植情況及妊娠結局比較：獲卵數≥21個組的患者年齡最小，獲卵數≤5個組的bFSH、所需Gn總量均高于其他組；獲卵數≤10個兩組的HCG日E2水平顯著低于其他組，獲卵數≥21個組的卵母細胞成熟率最低，獲卵數≤5個組的可利用胚胎率最高；累計活產率隨著獲卵數的增加而增加，獲卵數≥21個組的累計活產率最高(P均<0.05)。各組間不孕年限、HCG日內膜厚度、受精率、新鮮移植活產率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表7)。

5.獲卵數≤5個不同年齡間移植情況及妊娠結局比較：年齡≥35歲組的不孕年限顯著高于25～29歲組和30～34歲組，但獲卵數顯著低于25～29歲組和30～34歲組；年齡≥35歲組的Gn總量顯著高于其他組；年齡<25歲組的卵母細胞成熟率顯著低于其他組(P均<0.05)。各組間bFSH、Gn天數、HCG日E2水平、HCG日內膜厚度、受精率、可利用胚胎率、優質胚胎率、新鮮移植活產率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表8)。

表6 30～34歲組不同獲卵數間移植情況及妊娠結局的比較[(-±s)，%]

注：與獲卵數≤5個組比較，*P<0.05；與6～10個組比較，#P<0.05；與11～15個組比較，$P<0.05；與16～20個組比較，&P<0.05

表7 ≥35歲組不同獲卵數間移植情況及妊娠結局的比較[(-±s)，%]

注：與獲卵數≤5個組比較，*P<0.05；與獲卵數6～10個組比較，#P<0.05；與獲卵數11～15個組比較，$P<0.0 5；與獲卵數16～20個組比較，&P<0.05

表8 獲卵數≤5個不同年齡間移植情況及妊娠結局的比較[(-±s)，%]

注：與<25歲組比較，*P<0.05；與25～29歲組比較，#P<0.05；與30～34歲組比較，$P<0.05

討 論

既往對IVF/ICSI妊娠結局的評估指標很多，最常見的還是以新鮮移植妊娠率或累積妊娠率作為考量指標，但是這個指標存在很大的偏倚[2]。隨著ART的發展和胚胎冷凍技術的成熟，同時為減少卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的風險和多胎妊娠的發生，單胚胎或單囊胚移植和全胚冷凍的理念逐漸被接受[3]，這增加了FET的機會，因此，包含新鮮周期及FET周期的累計活產率成為能更好地反映一次完整IVF周期成功率的指標[4-5]。

一、年齡與ART

年齡對于卵巢儲備功能以及生育力的負面影響毋庸置疑，年齡越大，卵巢儲備功能越差，獲卵數越少，可利用胚胎以及優質胚胎數目越少，進而影響IVF妊娠成功率[6-7]。本結果顯示年齡超過35歲的患者，其獲卵數、優質胚胎率、新鮮移植活產率及累計活產率顯著下降，可能是因為隨著女性年齡的增長，卵母細胞內線粒體數量減少及功能下降，能量供應不足影響卵母細胞減數分裂；另一方面可能因為高劑量Gn的使用會干擾卵母細胞的正常減數分裂、代謝以及ATP產生，改變卵母細胞表觀遺傳學修飾、降低其發育潛能[8-9]。本結果還顯示年齡在30～34歲患者的可利用胚胎率(58.30% vs. 55.05%)及優質胚胎率(34.84% vs. 31.28%)顯著高于年齡<25歲的年輕患者。另有結果顯示年齡≤25歲患者的卵母細胞利用率顯著低于年齡>25歲患者，故并非大部分學者所認為的年齡越小，卵母細胞質量及胚胎質量越好，這可能是因為年齡偏小的患者在20歲初的時候仍處于卵泡快速閉鎖階段的末期，這預示著取到的部分卵母細胞可能已經啟動凋亡程序，因而卵母細胞質量較差[10]。

二、獲卵數與ART

表3結果顯示新鮮移植活產率隨著獲卵數的增加而增加，但是分析表4、5、6、7不同年齡組不同獲卵數比較得出，新鮮移植活產率并不隨著獲卵數的增加而增加。可能是因為促排卵過程中超生理劑量的促性腺激素的使用以及超生理的高雌狀態，破壞卵母細胞的發育調控和同步性，導致核質成熟的不同步，降低卵母細胞的成熟率，影響妊娠結局[11-12]。另外，過高的甾體激素可以改變與著床密切相關的分子、發育基因以及子宮內膜超微結構的時序性表達，使子宮內膜組織學變化與自然周期中的生理行為不符，導致腺體發育和間質發育的同步性喪失，使種植窗的開放與胚泡的發育不同步，影響胚胎著床，最終影響妊娠結局[13-14]。另外表 6也顯示30～34歲組不同獲卵數組間，新鮮移植活產率在獲卵數11～15個時達到最大，但累計活產率在獲卵數≥21個達最高，這與Steward等[15]和Sunkara等[16]的研究結果一致，可能因為當獲卵數≥21個時為預防OHSS而采取全胚冷凍的措施，而FET可能避免了卵巢高反應對子宮內膜容受性的不利影響。獲卵數過少導致可移植胚胎數目減少，從而影響妊娠結局，但是獲卵數過少是否同時伴胚胎質量下降目前尚未有定論。Cohen等[17]研究表明，對于卵巢反應不良的患者隨著獲卵數的減少同時伴隨卵母細胞質量、胚胎質量的下降，增加獲卵數并不能改善其妊娠結局，但Chang等[18]研究則表明，年輕卵巢低反應(poor ovarian response，POR)患者優質胚胎比例明顯高于老年POR組，但低于卵巢儲備正常組(P<0.01)。年輕POR患者的生化妊娠率、臨床妊娠率和胚胎著床率顯著高于老年POR患者。這說明年齡仍然是影響卵母細胞及胚胎質量的重要因素，對于年輕POR患者一旦獲卵仍能可以取得不錯的臨床結局。分析表8提示，對于獲卵數≤5個的患者，年齡25～29歲組的新鮮移植活產率以及累計活產率最大，與Chang等[18]研究相一致，但組間比較差異尚無統計學意義，可能與本研究樣本量小有關，今后仍需大樣本研究加以探討。

三、最佳獲卵數的臨床探討

獲卵數過多或過少都會影響IVF/ICSI妊娠結局，是否存在一個最適獲卵數范圍，國內外尚無統一結論。Zhou等[19]對首次接受IVF長方案的931名的35～40歲的女性研究發現，獲卵數為10～14個時，可獲得最佳的累計活產率，同時OHSS風險降至最低。Devesa 等[6]分析4 570名年齡在38歲以上的不孕癥婦女，在41歲之前，隨著獲卵數的增加，累計活產率呈上升趨勢，但43歲之后獲卵數的增加對累計活產率無益處。Ji等[8]對2 455名34歲以下的女性研究發現，隨著獲卵數的增加，累計活產率逐漸增加，但中、重度OHSS的發生率亦隨之升高。獲卵數6～15個時，可獲得最佳的新鮮周期活產率，且累計活產率較高，OHSS發生率較低，是較為理想的獲卵范圍。表5、6、7顯示年齡25～29歲患者，新鮮移植活產率在獲卵數6～10個可達到較為滿意的妊娠結局，對于30～34歲的患者，新鮮移植活產率在獲卵數為11～15個時獲得不錯的妊娠結局，但是對于≥35歲的患者獲卵數需達到16～20個才能獲得較佳的妊娠結局。因此，不同年齡段最佳獲卵數的范圍略有差別。并且在不同年齡組均顯示出累計活產率隨著獲卵數增加而上升的趨勢，這也顯現出新鮮移植活產率反映妊娠結局的局限性，故累計活產率可以更客觀全面地評估一次取卵周期的妊娠結局。

四、總結

ART過程中，年齡、獲卵數是與妊娠結局顯著相關的因素，尤其是女性年齡≥35歲時，新鮮移植及累計活產率顯著下降，且不同年齡段為達到最佳妊娠結局所需的獲卵數范圍不同，同時其累計活產率隨著獲卵數的增加而增加，所以累計活產率是評估IVF/ICSI成功率的重要指標。控制性促排卵過程中應充分評估患者的整體情況，制定個體化的促排卵方案，不僅要使患者一次取卵周期獲益最大化，同時要兼顧胚胎利用率、OHSS風險等方面，避免過多剩余胚胎造成的資源浪費和潛在的倫理問題。