六倍體披堿草屬的核型分析

楊財容，張海琴，劉松青，沙莉娜，周永紅*

（1.成都師范學院化學與生命科學學院，成都 611130；2.四川農業大學小麥研究所，成都 611130）

染色體是物種基因的載體。物種進化過程中的染色體結構與數量變化帶來基因的重新排列、基因數量的增加或減少，染色體結構與數量變化也是造成群體間生殖隔離的一個重要原因，進而形成新物種[1]。G.A.Levitsky[2]首次將核型定義為體細胞染色體的表型特征，即核型是指某種真核生物個體或某一分類群（種、亞種或變種、居群）的染色體數目、長度、臂比、著絲粒位置、有無隨體等形態特征的總和。染色體核型分析是細胞遺傳學研究中的一個基本方法，即通過觀察物種染色體形態特征，并按照一定的標準，人為地對物種染色體進行配對、編號和分組的過程。它易操作、經濟實惠的特點使其得到了廣泛使用，對研究物種起源與演化、物種分類、物種之間親緣關系以及植物遠緣雜交育種中的染色體鑒別發揮了重要作用[3-5]。

披堿草屬是小麥族中的一個大屬，包含了從四倍體到十倍體的物種，但是很多物種還缺乏生物系統學的詳細資料。劉玉紅、蔡聯炳和馮海生等[6-7]發現 E.atratus、E.breviaristatus、E.cylindricus 等物種的核型，但是結果顯示部分物種的核型不一致。六倍體披堿草屬物種分布廣泛，物種不同居群的核型可能存在變異。本研究分析了9 個六倍體披堿草屬物種的核型，探討物種不同居群的核型變異，為其后續理論研究和育種利用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究涉及六倍體披堿草屬物種9 個。所有材料的物種名稱、編號及來源列于表1。PI 編號材料由美國國家植物種質資源庫American National Plant Germplasm System（Pullman，Washington，USA）提供，其余材料由四川農業大學小麥研究所采集。所有材料均種植于四川農業大學小麥研究所多年生種質圃，憑證標本藏于四川農業大學小麥研究所標本室（SAUTI）。

表1 供試材料Table 1 Materials used in the study

1.2 試驗方法

1.2.1 根尖獲取

取飽滿的種子置于帶有濕潤濾紙的培養皿上，4 ℃解除休眠后， 置于25 ℃恒溫培養箱培養發芽，根長到一定長度后移栽于盆中。待種子根尖長到1～2 cm 時于上午或下午的合適時期剪取，將剪取的根尖置于空的離心管內置于N2O 中預處理2 h 左右，取出后用90%冰醋酸固定5 min 后，于70%酒精中保存。

1.2.2 滴片法制片

將于70%酒精中保存的3～5 個根尖用蒸餾水清洗3～5 次，用刀片切取分生區，將切下的部分轉入裝有10 μL 酶解液（含纖維素酶和果膠酶）的0.1 mL的EP 管中，再將其置于37 ℃的恒溫水浴鍋中酶解14 min 左右（酶解時間取決于根尖分生區的大小、老嫩等）。酶解結束后棄掉大部分的酶解液，然后用70%的酒精清洗兩次，再用解剖針輕輕搗碎組織，離心后棄掉液體，加入約30 μL 的100%冰醋酸，輕輕混勻后滴片。待載玻片自然干燥后滴加改良苯酚品紅染液染色，蓋上蓋玻片在Olympus BX-51（Olympus）下觀察并拍照。

酶解液的制備方法為：

①0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液（Citrate buffer，0.01 mol/L，pH 值 4.5）的配制：分別稱取 1.47 g 二水合檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）和水合檸檬酸（C6H8O7·H2O）1.05 g 溶解于 500 mL ddH2O 中；

②10 mL的0.01mol/L 檸檬酸緩沖液中加入400mg纖維素酶（cellulase）和 200 mg 果膠酶（pectinase），充分溶解后，分裝并保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.3 染色體核型分析

核型分析采用A.Levan 等[8]的兩點四區系統法確定著絲點類型，核型分類依照G.L.Stebbins[9]的分類標準進行，同時參照李懋學等[10]的植物核型分析標準，核型不對稱系數按照H.Arano[11]的方法計算。每個物種選取5 個分裂良好的細胞，利用Nuc-Type 2.0（四川大學）進行染色體長度測量，利用該軟件可直接輸出染色體參數以及核型模式圖。基于得到的染色體參數利用Excel 軟件對核型數據進行統計，并對同源染色體進行配對。最后，利用Photoshop 軟件，按照染色體的相對長度由長至短（短臂在上，長臂在下）的順序排列，著絲粒對齊排列于同一直線上，繪制核型圖。

2 結果與分析

9 個六倍體披堿草屬物種的染色體形態、 核型圖和核型模式圖見圖1，核型分析結果見表2。

E.atratus：核型公式為 2n=6x=42=38m+4sm。42條染色體中有4 條染色體為近中部著絲粒染色體，38 條為中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度介于3.44%～6.33%之間，染色體長度比為1.95。染色體臂比范圍為 1.02～2.07 之間，平均臂比為1.28，臂比大于2 的比例為4.76%。染色體不對稱系數為56.06%，核型為2A 型。

E.breviaristatus：核型公式為 2n=6x=42=34m+8sm。42 條染色體中8 條染色體為近中部著絲粒染色體，34 條中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度為3.58%～6.15%，染色體長度比為1.74。染色體臂比范圍為1.02～2.29， 平均臂比為1.35，臂比大于2 的比例為7.14%。染色體不對稱系數為57.52%，核型為2A 型。

E.cylindricus：核型公式為 2n=6x=42=36m+6sm。42 條染色體中6 條染色體為近中部著絲粒染色體，36 條中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度為3.76%～5.85%，染色體長度比為1.70。染色體臂比范圍為1.01～2.27， 平均臂比為1.29，臂比大于2 的比例為4.76%。染色體不對稱系數為56.31%，核型為2A 型。

圖1 六倍體披堿草屬物種的染色體形態、核型圖和核型模式圖Figure 1 Mitotic metaphase chromosomes， karyograms and ideograms of the hexaploid Elymus species.scale bar=10 μm.

表2 披堿草屬物種核型參數Table 2 Parameters of karyotype of Elymus species

E.dahuricus：核型公式為 2n=6x=42=36m+6sm。42 條染色體中6 條染色體為近中部著絲粒染色體，36 條中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度為3.91%～5.80%，染色體長度比為1.62。染色體臂比范圍為1.05～1.93， 平均臂比為1.30，臂比大于2 的比例為2.38%。染色體不對稱系數為56.61%，核型為2A 型。

E.excelsus：核型公式為 2n=6x=42=34m+8sm。42 條染色體中8 條染色體為近中部著絲粒染色體，34 條中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度為3.94%～5.78%，染色體長度比為1.63。染色體臂比范圍為1.02～2.35，平均臂比為1.36，臂比大于2 的比例為11.9%。染色體不對稱系數為57.67%，核型為2A 型。

E.nutans：核型公式為 2n=6x=42=38m+4sm。42條染色體中4 條染色體為近中部著絲粒染色體，38條中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度為3.46%～5.79%，染色體長度比為1.78。染色體臂比范圍為1.03～2.86，平均臂比為1.37，臂比大于 2 的比例為 7.14%。染色體不對稱系數為57.82%，核型為2A 型。

E.purpuraristatus：核型公式為2n=6x=42=36m+6sm。42 條染色體中6 條染色體為近中部著絲粒染色體，36 條中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度為3.49%～6.18%，染色體長度比為1.87。染色體臂比范圍為1.03～2.35， 平均臂比為1.32，臂比大于2 的比例為7.14%。染色體不對稱系數為56.97%，核型為2A 型。

E.sinosubmuticus：核型公式為2n=6x=42=36m+6sm。42 條染色體中6 條染色體為近中部著絲粒染色體，36 條中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度為3.48%～6.44%，染色體長度比為2.03。染色體臂比范圍為1.05～2.39， 平均臂比為1.33，臂比大于2 的比例為7.14%。染色體不對稱系數為57.17%，核型為2B 型。

E.tangutorum：核型公式為2n=6x=42=36m+6sm。42 條染色體中6 條染色體為近中部著絲粒染色體，36 條中部著絲粒染色體，無隨體染色體。染色體相對長度為3.78%～6.26%，染色體長度比為1.75。染色體臂比范圍為1.06～1.95，平均臂比為1.33，臂比大于2的比例為7.14%。染色體不對稱系數為57.02%，核型為2A 型。

3 討論與結論

劉玉紅[6]于 1985年報道 E.atratus、E.breviaristatus、E.cylindricus、E.dahuricus、E.nutans 和 E.tangutorum 的核型類型為1A 型，在本文中以上物種的核型類型均為2A 型，其報道E.excelsus、E.purpuraristatus 的核型類型為2A 型，與本文結果一致。蔡聯炳和馮海生等[7]于1997年報道E.breviaristatus和E.sinosubmuticus 的核型為 2A 型，E.breviaristatus的核型類型與本文一致， 本文發現E.sinosubmuticus 的核型為2B 型， 其報道的染色體相對長度、隨體染色體條數等染色體參數與本文報道結果不一致，我們認為造成上述差異的原因可能有①材料居群間的核型分化。六倍體披堿草屬物種分布廣泛，所選擇材料的來源不一樣，染色體核型可能存在分化，從而表現出差異性；②染色體核型的研究主要基于染色體長度的測量， 人工測量采用的方法，以及測量的角度均不同，都將對結果造成誤差；③隨體作為染色體的一個重要特征，可能受到制片過程的影響，制片過程中預處理時間太長會造成染色體太短，隨體不容易分辨，另外傳統壓片法以及最新的酶解滴片法對染色體的物理結構影響也不同。

本研究的六倍體披堿草屬物種的染色體主要以中部著絲粒染色體為主，有少量亞中部著絲粒染色體。各個物種間的核型參數（染色體相對長度，染色體長度比，染色體臂比，平均臂比，臂比大于2 的比例）等均存在差異。但是從核型公式來看，E.dahuricus 復合群內的物種 E.cylindricus，E.dahuricus，E.purpuraristatus、E.tangutorum 的核型一致，均為 2n=6x=42=36m+6sm， 復合群內另一個物種E.excelsus的核型不同，為2n=6x=42=34m+8sm，但是復合群內的物種核型類型均為2A 型， 說明親緣關系較近的復合群內物種核型特征也具有相似性。T.Oinuma[12]認為物種核型和物種染色體組存在平行進化關系，前人研究表明復合群內物種E.dahuricus 染色體組組成為StYH[13]，可能復合群內其他物種也具有相同的染色體組組成。E.breviaristatus 和E.sinosubmuticus 的核型存在差異，分別為2A 和2B，究竟二者親緣關系如何還有待進一步研究。