不明原因復發性自然流產患者HVEM基因多態性檢測研究*

肖 海，婁桂予，張 倩，郭謙楠，張照婧，吳 東，張夢汀，高 越，廖世秀△

(1.河南省人民醫院醫學遺傳研究所，鄭州 450003；2.鄭州大學基礎醫學院醫學遺傳與細胞生物學系 450003)

妊娠期間的胎兒和母體之間存在著復雜的免疫調節，母-胎界面調節性T細胞(Treg)優勢分化，有利于妊娠的順利進行。皰疹病毒侵入介質(herpes virus entry mediator,HVEM)基因上的一些單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點會對基因的表達或者功能造成影響，目前在很多腫瘤的研究中發現HVEM基因多態性會影響Treg的分化，進而影響疾病的發生發展[1]。目前尚無HVEM基因多態性與不明原因復發性自然流產(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)關系的相關報道。本文通過對河南漢族人群的HVEM基因 rs1886730和rs2234167位點進行研究，探討HVEM基因多態性與河南漢族人群URSA的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例組為2017年1-12月在河南省人民醫院產前診斷中心就診的246例復發性流產女性。入選標準：自然流產大于或等于3次，排除感染、血型不合、生殖道畸形、免疫因素、內分泌異常、胚胎染色體異常等致病因素。對照組為2017年1-12月在河南誠信法醫司法鑒定所進行親子鑒定生育過1名及以上正常健康孩子且無復發性流產史的256例女性。本研究經河南省人民醫院倫理委員會批準。所有研究對象知情同意后分別抽取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血2 mL。

1.2方法

1.2.1rs1886730和rs2234167位點SNP檢測 采用廈門致善公司的Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑提取樣本基因組DNA，PCR擴增后利用Sanger法測序檢測樣本基因型。根據參考文獻[1]設計引物，引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。PCR反應體系：模版DNA 1.0 μL 2×PCR，Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，去離子水9.5 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環；72 ℃總延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.2基因型判讀 擴增產物電泳后，切膠回收，利用Sanger測序法進行測序。測序結果與NCBI中的野生型序列進行Blast比對分析，判斷位點基因型。

1.3統計學處理 應用SHEsis軟件[2-3]在線分析數據，對HVEM基因rs1886730和rs2234167位點基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，采用χ2檢驗比較2組間基因型頻率和等位基因頻率的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列

2 結 果

通過Sanger測序發現246例病例組患者和256例對照組婦女HVEM基因的rs1886730位點有3種基因型，分別為CC、CT、TT，rs2234167位點有2種基因型，分別為GG和GA。河南漢族人群中HVEM基因rs2234167位點多態性與URSA無明顯相關性(P>0.05)；rs1886730位點T等位基因頻率在病例組和對照組間差異有統計學意義(t=14.007，P<0.01)，CT、TT基因型頻率在病例組和對照組間差異有統計學意義(t=14.236，P<0.01;t=14.420，P<0.01)。見表2、3。

表2 rs1886730基因型和等位基因在病例組和對照組的分布[n(%)]

表3 rs2234167基因型和等位基因在病例組和對照組的分布[n(%)]

-：無數據

3 討 論

自然流產是指妊娠在28周以前終止、胎兒體質量在1 000 g以下者，發生率為15%～20%[4]。復發性自然流產(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指連續發生3次及以上自然流產的，是妊娠常見的并發癥之一，發生率約為1%[5]。RSA病因極其復雜，目前已知致病因素有染色體異常、內分泌失調、生殖器官畸形、感染、環境理化等。除上述病因以外，仍有大約50%的RSA患者的致病因素不明，臨床上稱之為URSA[6-7]。URSA會對廣大婦女的身體和心理造成巨大的傷害。由于URSA致病因素復雜多樣，且發病機制尚不明確，雖然目前有很多防治手段如：中西醫結合方法、免疫抑制劑、抗凝療法、主動免疫療法及被動免疫療法等，但療效均不明確。因此，探索URSA的發病機制對其防治具有十分重要的意義。

妊娠類似于同種異體移植過程，帶父系抗原的胚胎不被母體免疫系統排斥，是因為胎兒與母體之間存在著復雜的免疫調節過程，通過這種相互作用建立的母-胎免疫耐受微環境保證了妊娠的順利進行[8-9]。代孕的胎兒所攜帶的人類白細胞抗原系統與母體的完全不同，進一步證實了母-胎免疫耐受微環境的存在[10]。研究表明自然流產模型組Treg顯著低于正常妊娠組，過繼轉輸Treg至流產模型小鼠可改善其妊娠預后，提示Treg不但參與了母-胎免疫耐受機制的形成而且對其維持有重要作用。樹突狀細胞( dendritic cells,DCs)是一種抗原遞呈細胞，DCs表面可表達B和T細胞衰減因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)[11-12]。DCs可通過與廣泛表達在T細胞表面的HVEM特異性結合對T細胞起到調節作用，達到母-胎界面Treg優勢分化的狀態，從而有助于維持母-胎界面免疫耐受狀態。BTLA/HVEM信號通路在腫瘤的T細胞抑制中發揮重要作用[13]。BTLA+DEC205+CD8+DCs可以通過BTLA/HVEM信號通路誘導Treg分化[14-15]。胚胎作為一種半同種移植物，能夠不被排斥，有賴于母胎間的免疫耐受，特別是母-胎界面免疫微環境的形成和維持，這種耐受一旦被破壞，則導致病理性妊娠。基因多態性可引起蛋白結構和功能的改變，導致DCs無法通過BTLA/HVEM信號通路誘導Treg分化，即不同個體對URSA表現出不同的易感性。

有報道稱rs1886730位點的基因多態性與乳腺癌的易感性相關[1]。本研究結果顯示rs1886730位點CT、TT基因型在URSA組中的分布頻率顯著高于對照組，且T等位基因在URSA中的分布頻率高于對照組，提示此位點與河南漢族人群URSA的發病有關。rs1886730位于HVEM基因內含子區域，內含子區域在轉錄過程中起重要作用，內含子區域發生基因突變，可能導致剪切位點的改變從而影響mRNA的二級結構，影響蛋白的功能。CT、TT基因型為河南漢族人群URSA發病的風險基因型。T等位基因為河南漢族人群URSA發病的風險等位基因。

rs2234167位于HVEM基因的外顯子區域，該位點基因突變導致編碼的氨基酸由纈氨酸變為異亮氨酸。有報道rs2234167位點多態性會影響HVEM的功能和表達，進而對乳腺癌的發生發展產生影響[1]。本研究結果顯示病例組中的GA基因型頻率和A等位基因的頻率均略高于對照組，但兩組數據差異無統計學意義(P>0.05)，并且本研究在河南漢族人群中未檢測到AA基因型。推測該位點多態性存在種族差異，有必要擴大樣本量，進一步確定該位點與URSA的關系。