銅綠假單胞菌整合子分布差異與耐藥性的關系*

徐令清,黃圳婷,湯英賢,李玉珍,溫偉洪,陳凌娟,王 歡,李介華

(廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院/清遠市人民醫(yī)院檢驗科，廣東清遠 511518)

銅綠假單胞菌(PA)具有內在廣泛耐藥屬性，是臨床上比較常見的條件致病菌。碳青酶烯類抗菌藥物如亞胺培南等具有抗菌譜廣、抗菌活性強等特點。有研究表明，亞胺培南顯示出對PA良好的抗菌活性，是治療PA的首選藥物[1]，但隨著抗菌藥物在臨床上廣泛應用，PA耐藥情況也日益嚴峻,尤其是耐碳青酶稀類銅綠假單胞菌(CRPA)[2]，給臨床的防治工作帶來很大困難。研究發(fā)現，整合子已成為細菌產生和傳播耐藥性的重要機制[3]。本研究對臨床分離的68株PA中整合酶基因及可變區(qū)基因盒進行檢測，以探討整合子攜帶與細菌耐藥的關系，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2017年1～12月臨床分離的非重復PA 共68株。68株PA科室分布存在差異,其中ICU 23株、腦科12株、呼吸內科9株、胃腸外科8株、肝膽外科4株、兒科3株、燒傷科3株，其余科室6株。其中整合子陽性7株，分布在呼吸內科3株、ICU 3株和腦科1株。按2016年美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)標準判斷結果，最低抑菌濃度(MIC)≥8 μg/mL判定為亞胺培南或美羅培南耐藥，對二者之一耐藥確定為CRPA； MIC<8 μg/mL為碳青霉烯類敏感。其中CRPA共27株，碳青酶烯類敏感PA有41株。其中，分離自痰液43株(63.24%)，傷口分泌物8株(11.76%)，中段尿5株(7.36%)，膽汁4株(5.88%)，引流液2株(2.94%)，血液2株(2.94%)，其他4株(5.88%)。質控菌株為銅綠假單胞菌 ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922。整合子陽性對照菌株為肺炎克雷伯菌，通過上海生工生物有限公司測序確定后保留。

1.2儀器與試劑 儀器：BD phoenix100全自動細菌鑒定儀(美國BD公司)；T100TM PCR擴增儀、電泳儀、Gel DoxTM XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。試劑：哥倫比亞血瓊脂平板(廣州迪景微生物科技有限公司)；細菌組DNA提取試劑盒，2×Taq PCR MasterMix，Gel Red核酸染料和Marker Ⅰ、Ⅲ DNA Ladder(北京天根生化科技有限公司)；引物(上海英駿生物技術有限公司合成)。

1.3方法

1.3.1細菌總DNA提取 按細菌組DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，使用核酸蛋白檢測儀檢測總DNA濃度和純度，260 nm和280 nm光密度(OD)比值(OD260/OD280)為1.7～1.9時為合格，濃度調整為約50 ng/μL，于-80 ℃保存。

1.3.2整合酶基因PCR檢測 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子整合酶基因(分別為Int 1、2、3)PCR反應體系[4]為：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，其中包含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液等，上、下游引物各0.5 μL(10 ng/μL)，DNA模板0.5 μL(模板濃度10 ng/μL)，補充ddH2O至25.0 μL；反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL產物點樣在2%瓊脂糖凝膠中電泳60 min，電壓為80 V，以100～1 200 bp的MarkerⅡDNA Ladder作為參照，凝膠成像系統(tǒng)分析并處理結果。參照文獻[4]，Int 1、2、3及可變區(qū)所用的引物序列見表1。

1.3.3可變區(qū)PCR檢測 整合子可變區(qū)PCR反應體系[5]為：2 × Taq PCR MasterMix 25.0 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 ng/μL)，DNA模板1.0 μL，補充ddH2O至50.0 μL；反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取5 μL產物點樣在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳60 min，以200～4 500 bp的MarkerⅢDNA Ladder作為參照，電壓為80 V，凝膠成像系統(tǒng)分析并處理結果。

1.3.4可變區(qū)測序分析 可變區(qū)PCR產物由上海生工生物有限公司純化和測序，測序圖譜結果使用Chromas軟件進行序列拼接校正，使用BLAST(www.pubmed.com)進行比對分析，選擇匹配度最高結果。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1IntI 1、2、3分布 68株PA中共檢出IntI 1 7株，檢出率為10.29%(7/68)，未檢出IntI 2、3。檢出27株CRPA，其中IntI 1 7株，檢出率為25.9%(7/27)；在碳青酶烯類敏感PA中未檢出Ⅰ類整合子整合酶基因。部分菌株整合子整合酶基因PCR結果見圖1。

表1 三類整合子中整合酶基因及可變區(qū)的引物序列

IntⅠ 1、2、3分別對應Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子中5′-保守末端的整合酶基因，若其出現陽性表達，則代表對應整合子陽性

M：MarkerⅡDNA Ladder(100～1 200 bp)；1～7：IntI 1基因陽性菌株；8：陽性對照；9：IntI 1基因陰性菌株；10：空白對照

圖1部分Ⅰ類整合酶基因PCR擴增結果

2.2Ⅰ類整合子與各種抗菌藥物耐藥率的關系 Ⅰ類整合子陽性菌株對各類抗菌藥物耐藥率除粘菌素外均高于Ⅰ類整合子陰性菌株，其差異除了氨曲南外均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。Ⅰ類整合子陽性檢出率與耐藥性相對危險度(RR)分析見表3。

表3 Ⅰ類整合子陽性檢出率與耐藥性RR分析

2.3整合子可變區(qū)擴增結果 7株Ⅰ類整合子陽性菌株經過PCR及電泳后，出現明顯條帶的有6株，其片段長度在2 000～5 000 bp之間，大小不等，見圖2；其余20株CRPA也進行了可變區(qū)擴增，顯示有3株在500～800 bp處也出現條帶。見圖3。

M：Marker Ⅲ DNA Ladder(200～4 500 bp)；1、2、4～7：整合子可變區(qū)陽性標本；3：可變區(qū)陰性標本；8：空白對照

圖27株Ⅰ類整合子陽性菌株可變區(qū)PCR結果

M：Marker Ⅲ DNA Ladder(200～4 500 bp)；3、4、9：Ⅰ類整合子陰性CRPA可疑條帶可變區(qū)

圖3部分CRPA可變區(qū)PCR結果

2.5可變區(qū)基因盒測序結果 7株Ⅰ類整合子陽性菌株可變區(qū)產物及3株出現可疑條帶可變區(qū)PCR產物共10株的測序結果顯示，7株Ⅰ類整合子陽性菌株可變區(qū)有6株測序成功，其攜帶基因盒類型如表4所示。共檢出12種耐藥基因:ant(2″)-Ⅰa、aadA1、aadA4、aadB、aadA2、aadA15、blaVIM-2、blaVIM-3、blaOXA-2、arr-6、qnrVC1和cmlA15。其余3株可疑條帶檢測出4種耐藥基因盒，分別是arr-2、cml45、blaOXA-10和aadA1。

表4 7株Ⅰ類整合子整合酶基因陽性菌株的耐藥表型及可變區(qū)基因盒組合情況

a：碳青酶烯類(亞胺培南、美羅培南)；b：氨基糖苷類(阿米卡星、慶大霉素)；c：喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)；d：頭孢菌素類(頭孢他啶、頭孢吡肟)；e：廣譜青霉素(哌拉西林)；f：青霉素/β-內酰胺酶抑制劑復合物(哌拉西林/他唑巴坦)；g：單環(huán)內酰胺類(西氟南)；-：未檢出

3 討 論

PA是臨床上常見的條件致病菌。本研究收集的PA菌株中ICU檢出率最高，為33.8%，可能是由于ICU中多為高齡、免疫力低下、各種較嚴重急慢性疾病患者，以及住院時間長、侵入性操作多等危險因素導致感染率增加[6]，所以醫(yī)院要對ICU加強消毒管理和監(jiān)測。碳青酶烯類抗菌藥物如亞胺培南等是臨床上常用于治療PA的強效物，有報道稱近年來其耐藥率逐年上升[7]。本研究中CRPA檢出率為39.7%(27/68)，而且在這些耐藥菌中對其他種類抗菌藥物如青霉素類、頭孢菌素類和喹諾酮類等也有較高的耐藥性，可能與誘導耐藥有關。

整合子是一類可以通過位點特異性重組方式捕獲、剪切、整合外源性耐藥基因的DNA元件[8]，其被認為是導致抗菌藥物抗性、毒性和致病性產生及擴散的移動元件[9]。其基本組成包括5′-保守末端、3′-保守末端及中間的可變區(qū)，可變區(qū)可在整合酶作用下插入一個或者多個耐藥基因盒，使得細菌表現出相應耐藥特征。根據5′-保守末端中編碼整合酶的IntⅠ基因的不同，整合子目前可以分為6類，最常見的是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子。

本研究發(fā)現，68株PA中共檢出Ⅰ類整合子7株，檢出率為10.29%(7/68)，未檢出Ⅱ類和Ⅲ類，比文獻報道略低[10-13]，可能存在地區(qū)或選取菌株的差異。其中27株CRPA中Ⅰ類整合子陽性率(25.9%)比41株碳青酶烯類抗菌藥物敏感菌株陽性率(0)高，Ⅰ類整合子陽性菌株對絕大多數抗菌藥物耐藥率均高于Ⅰ類整合子陰性菌株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過RR分析發(fā)現，Ⅰ類整合子陽性菌株除粘菌素外耐藥高于陰性菌株，除氨曲南外差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可知，整合子的攜帶對細菌耐藥起著重要作用，兩者有著密切關系，因此在治療中需要關注是否為整合子攜帶的致病菌感染。

目前在Ⅰ類整合子陽性菌株可變區(qū)中發(fā)現的耐藥基因盒眾多，本研究在6株Ⅰ類整個子陽性菌株的可變區(qū)中共檢出12種耐藥基因盒。其中ant(2″)-Ⅰa、aadA1、aadA4、aadB、aadA2、和aadA15為編碼氨基糖苷類藥物的耐藥基因[14]；blaOXA-2、blaVIM-3和blaVIM-2為編碼β-內酰胺類藥物的耐藥基因[15]；arr-6與利福平藥物耐藥有關；qnrVC1基因與喹諾酮類耐藥有關； cmlA15基因與氯霉素耐藥有關[16]。通過分析可變區(qū)測序結果，耐藥基因和耐藥表型具有較好的一致性，但也有些菌株表達了耐藥表型卻未檢出耐藥基因盒，如2、3、4和5號菌株都對喹諾酮類耐藥，卻未檢出相應的耐藥基因盒，可能存在其他耐藥機制。

綜上研究，整合子的攜帶與細菌耐藥性有著密切的聯系，應加強監(jiān)測和減少抗菌藥物濫用。整合子的研究，對于了解細菌耐藥的發(fā)生和傳播機制具有重要作用。