乳酸堆積對肝星狀細胞增殖、分化、凋亡的影響*

孫 輝，馬凌波，董 飛，胡光榮△,何永捍，鄧 穎

(1.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院急診科 150081;2.中國科學院昆明動物研究所,昆明 650223)

肝纖維化是慢性肝損傷所致的病理改變，表現為肝內細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分過度沉積[1-2]，并影響肝臟的功能。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝內ECM主要來源的HSCs，是肝纖維化形成的細胞學基礎[3-4]的增殖、分化是肝纖維化的中心環節。肝硬化是各種慢性肝病所致肝功能受損從而影響體內糖代謝的轉化[5]，導致乳酸在體內的異常堆積，使細胞生存的微環境發生改變，刺激纖維結締組織的大量增生所致。但乳酸堆積對HSCs的影響尚未見文獻報道。本實驗采用體外培養的HSCs制作乳酸堆積模型，探討乳酸堆積對HSCs增殖、分化和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人HSCs(上海坤肯生物化工有限公司)，反轉錄試劑盒(ABI AppliedBiosystems公司,美國)，L-乳酸、胎牛血清(Sigma公司,美國)，TRIzol，引物(Invitrogen公司,美國)，AnnexinV/PI雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT，上海碧云天生物技術有限公司)，CO2培養箱、光學顯微鏡、流式細胞儀、Real-time PCR儀(Thermo公司,美國)。

1.2方法

1.2.1HSCs的培養 HSCs細胞接種于25 cm2無菌培養瓶中，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液5 mL，置于37 ℃、含5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，當細胞生長融合至80%～90%時進行實驗。

1.2.2細胞分組 把傳代好的HSCs分為4組，乳酸終濃度為0 mmol/L(對照)、0.5 mmol/L(HSCs+0.5 mmol/L乳酸組)、1.0 mmol/L(HSCs+1.0 mmol/L乳酸組)、2.0 mmol/L(HSCs+2.0 mmol/L乳酸組)，分別培養72 h，其中以含0 mmol/L乳酸的HSCs為對照組。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖 取生長狀態良好的HSCs，用0.25%胰酶消化，加入等量培養液中和胰酶并離心，棄上清液后加入PBS，再離心后加入不同乳酸濃度的培養液制成含細胞數為5×107/L的細胞懸液，接種于96孔板上，每孔200 μL，每組設6個復孔，同時設只加培養基而無細胞的空白對照孔。將各組細胞放置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱內培養72 h后，加人20 μL MTT(5 g/L)后再培養4 h，離心棄上清液后加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩15 min，使用全自動酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。HSCs增殖抑制率(%)=(1-各實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.4流式細胞儀測定HSCs凋亡和細胞周期 HSCs凋亡檢測:把生長良好的各組細胞經消化、離心后分別調整為含細胞數為5×106/mL的細胞懸液，各組分別取1 mL于離心管中，經反復離心洗滌混勻后，各組分別取250 μL，加入5 μL PI和10 μL AnnexinV-FITC，充分混合均勻后室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗每組重復3次。細胞周期檢測：各組細胞培養72 h后用0.25%胰酶消化收集細胞，PBS洗2遍，棄上清液，加入1 mL 70%預冷乙醇，吹打均勻，4 ℃過夜固定(12 h以上)。PBS洗滌去乙醇，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2遍。0.5 mL PBS重懸細胞，加入PI和 RNase A至終濃度50 μg/mL，37 ℃ 溫浴30 min。用流式細胞儀測定細胞周期，實驗每組重復3次。

1.2.5real-time PCR法檢測α-SMA和Fasl mRNA

1.2.5.1提取總RNA 各組細胞培養72 h后,棄培養液,向24孔板中每孔加入0.2 mL TRIzol反復吹打后刮取裂解液分別移至滅菌的1.5 mL EP管中，室溫下靜置5 min。每組EP管中加0.2 mL氯仿，經震蕩(15 s)-靜置(2 min)-離心(4 ℃，13 500×g、15 min)-上清液移管后，加入0.5 mL的異丙醇，再經震蕩-靜置(10 min)-離心(4 ℃，13 500×g、10 min)-棄上清液后，加入1 mL 75%乙醇，最后輕洗沉淀-離心(4 ℃，10 600×g、5 min)-棄上清-室溫晾干后，加入DEPC水溶解并保存于冰上，待檢。

1.2.5.2逆轉錄合成cDNA 先測定總RNA濃度。按試劑盒操作說明書操作，將0.5 μg的樣本RNA、0.5 μL RTase、0.4 μL dNTP、1.0 μL 10×RT buffer、1.0 μL引物、7.5 μL雙蒸水配成10 μL反轉錄體系，上機。

1.2.5.3real-time PCR分析 首先在real-time PCR儀中進行40個循環(95 ℃15 s，60 ℃ 1 min)，緊接著在95 ℃條件下用SYBR Green PCR Master Mix進行變性10 min；利用ABI Prism?快速7500型熒光定量PCR儀對cDNA進行擴增。結果用實驗組目的基因相對于對照組基因變化的2-ΔΔCt表示。各基因real-time PCR引物序列見表1。

1.2.6caspase-3活性檢測 各組細胞培養經胰蛋白酶消化、PBS洗滌后制備成細胞數為1×106/mL的單細胞懸液，取1 mL于離心管中經離心(1 000 r/min、5 min)后棄上清液，加入50 μL預冷的細胞裂解液，冰浴10 min，再以1 000 r/min離心5 min，棄上清液后加入5 μL caspase-3底物(DEVD-FC)和50 μL 2×反應緩沖液/二硫蘇糖醇(DTT)混合液，37 ℃恒溫水浴1 h，上機待檢。caspase-3相對活性=實驗組熒光強度/對照組熒光強度。

表1 real-time PCR引物序列

2 結 果

2.1乳酸對HSCs增殖的影響 不同濃度乳酸培養HSCs 72 h后用MTT法檢測HSCs的增殖能力發現，低濃度(≤2 mmol/L)乳酸對HSCs增殖具有明顯促進作用(P<0.05) ，之后隨著乳酸濃度的增加，乳酸對HSCs毒性增加，對HSCs生長有明顯的抑制作用(P<0.05)，見表2。

2.2乳酸對HSCs的凋亡和細胞周期的影響 不同濃度乳酸培養HSCs 72 h后采用流式細胞儀檢測HSCs凋亡和細胞周期發現，在乳酸濃度為0、0.5、1.0、2.0 mmol/L時HSCs的凋亡率與對照組比較，逐漸減少，差異有統計學意義(P<0.05)；低濃度乳酸作用72 h可調節細胞周期，G0/G1期細胞減少，S期細胞增加，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表3。

2.3乳酸對HSCs的凋亡基因FasL mRNA的表達和caspase-3活性的影響 各低濃度乳酸組與對照組比較，凋亡基因FasL mRNA的表達明顯減少(P<0.05)，caspase-3活性明顯降低(P<0.05)，并且其變化趨勢與乳酸濃度呈劑量效應，見圖1A、B。

2.4乳酸對HSCs ECM中α-SMA mRNA的影響 real-time PCR檢測結果顯示，與對照組比較，低濃度乳酸可明顯刺激細胞外基質α-SMA mRNA的表達(P<0.05)，見圖1C。

表2 乳酸對HSCs的抑制率

-：此項無數據；a：P<0.05，與對照組比較

表3 乳酸對HSCs凋亡和細胞周期的影響

a：P<0.05，與對照組比較

A:FasL;B：caspase-3;C:α-SMA;a：P<0.05，與對照組比較

圖1乳酸對HSCsFasL、caspase-3、α-SMAmRNA表達的影響

3 討 論

各種致病因子可導致肝內基質異常地沉積、結締組織異常增生，肝損傷在修復愈合的過程中伴有肝纖維化發生，長期的纖維化過程則會發展成肝硬化。目前對肝纖維化的研究主要集中在HSCs的激活、肝內基質合成和降解失衡、有關的細胞因子(如TNF-α、PDGF、TGF-β等)、天然免疫和獲得性免疫系統[6-7]等方面。而HSCs的激活則是肝纖維化形成的中心環節[8-9]，損傷的肝細胞釋放細胞因子如PDGF、TGF-β等，導致HSCs被激活，活化的HSCs分泌合成ECM增多，并轉化為成纖維細胞。α-SMA是ECM的成分之一，是HSCs活化的標志物[10]，若肝臟中出現α-SMA陽性細胞表示HSCs開始向肌成纖維細胞轉化，促進肝纖維化的發生。

目前的研究認為激活的HSCs有兩個去向:發生細胞凋亡[11]和由激活態轉變回靜止態[12]。活化的HSCs通過發生細胞凋亡而消除,是纖維化逆轉的主要機制。HSCs凋亡主要通過死亡受體信號傳導通路，當死亡因子Fas及其配體FasL結合時，啟動凋亡通路，引起下游的caspase-3等表達，導致細胞凋亡。

本研究通過體外培養人HSCs，加入不同濃度的乳酸培養基來模擬慢性肝病時體內乳酸堆積的情況，觀察乳酸堆積對HSCs的影響。結果發現，低濃度(≤2 mmol/L)乳酸能激活HSCs，促進其增殖，但是當乳酸濃度持續增高后，乳酸對HSCs的毒性增強，引起細胞凋亡。在低濃度乳酸刺激下，HSCs由G0/G1期進入S期的過程增加，導致G0/G1期細胞減少，處于S期的細胞則相應增加，同時細胞的凋亡率明顯減少。目前認為細胞周期有2個突發性的轉折點：G1至S期及G2至M期[13]。因此認為，低濃度乳酸對HSCs的細胞周期具有重要的調控作用，使S期的細胞明顯增加而處于增殖狀態，提示低濃度乳酸對肝纖維化的作用可能是通過影響HSCs的增殖周期實現的。在低濃度乳酸刺激下，HSCs分泌α-SMA增加，促進HSCs向成纖維細胞分化，進一步加重肝纖維化。在低濃度乳酸刺激下，FasL mRNA的表達減少和caspase-3活性降低，故推測低濃度乳酸對HSCs凋亡的影響可能是通過抑制死亡受體通路的激活和降低凋亡執行蛋白caspase-3的活性。

總之，本研究從分子水平證實了低濃度乳酸可促進HSCs增殖，使細胞從靜止期(G0)進入分裂間期；促進ECM合成，減少細胞凋亡的死亡受體通路激活，抑制HSCs凋亡，使HSCs向成纖維細胞分化，增加肝纖維化風險。