活絡(luò)效靈丹加減方對大鼠急性軟組織損傷的保護作用及機制初探

鄢紅玉，萬 飛，郭劍華，王建軍，魏東華△

(1.重慶市江津區(qū)中醫(yī)院中醫(yī)科 402284；2.重慶醫(yī)藥高等專科學校中醫(yī)學院 401331；3.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院筋傷中心 400010；4.重慶市江津區(qū)中醫(yī)院骨科 402284)

在骨傷科中，急性軟組織損傷是一種臨床常見且多發(fā)的疾病，患者主要表現(xiàn)為疼痛、腫脹、青紫瘀斑和功能性障礙等，給患者的生活和工作帶來不便[1]。中醫(yī)學觀點認為，急性軟組織損傷屬于“筋傷”的范疇。所謂“筋”，根據(jù)解剖學相關(guān)知識，主要指人體的皮膚、皮下的深淺筋膜、肌腱、肌肉、韌帶、腱鞘、滑膜囊、關(guān)節(jié)囊、椎間盤及周圍神經(jīng)、血管等相關(guān)軟組織。因各種急性外力造成上述“筋”發(fā)生病理性損害的統(tǒng)稱為“筋傷”[2-3]，故中醫(yī)治療主要以“舒筋活絡(luò)、活血消腫、祛瘀止痛”為主[4]。對這類疾病，西醫(yī)藥尚缺乏特效治療方法，而中醫(yī)藥療效較好且不良反應(yīng)較小，故引起研究者們的關(guān)注。活絡(luò)效靈丹加減方以“通絡(luò)祛瘀”等中醫(yī)理論作為指導，在當歸、丹參、乳香、沒藥的基礎(chǔ)上，酌加牛膝、地龍、赤芍、雞血藤，諸藥合用，共奏“抗炎、祛瘀、鎮(zhèn)痛”之效。活絡(luò)效靈丹出自張錫純所著《醫(yī)學衷中參西錄》[5]，雖為名方，在臨床有一定的應(yīng)用，但基礎(chǔ)研究甚少，具體機制研究就更為鮮有。

現(xiàn)代醫(yī)學對軟組織的認識已經(jīng)到了細胞、分子水平，認為軟組織損傷發(fā)生時，機體最初的自身保護性反應(yīng)為炎癥，而發(fā)生炎癥的核心問題為機體微循環(huán)的改變，受外部因素和內(nèi)部細胞損傷的激發(fā)會促使機體釋放出一系列炎癥相關(guān)介質(zhì)，一起對抗損傷，完成結(jié)構(gòu)、功能恢復[6]，從而誘發(fā)紅腫、脹痛等一系列臨床癥狀。緩解炎癥為緩解急性軟組織損傷患者疼痛的一個重要方向。Toll樣受體(TLRs)信號通路是學者所公認的炎癥調(diào)控通路，若TLRs受到刺激，可進一步活化核因子-κB(NF-κB)、干擾素等通路[7]。故本實驗通過建立大鼠急性軟組織損傷模型，驗證該方療效，并從炎癥相關(guān)因子及可能影響其分泌的TLR2/NF-κB信號通路出發(fā)，對其可能機制進行初步探索，為其在臨床發(fā)揮更大價值而奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗藥物 活絡(luò)效靈丹加減方：由當歸、丹參、乳香、沒藥、牛膝、地龍、赤芍、雞血藤組成，飲片來源于重慶醫(yī)藥高等專科學校附屬江津區(qū)中醫(yī)院的中藥房，使用時將以上藥材,用水浸泡30 min后，武火煮沸，文火10 min后配成每組所需濃度。 阿司匹林腸溶膠囊：規(guī)格為100 mg/粒，來源于永信藥品工業(yè)(昆山)有限公司，生產(chǎn)批號為20161204，批準文號為國藥準字H19990212。

1.2常用試劑 白細胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-10 ELISA試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為20160910、20160730、20160721、20160812、20160719、20150912、20151209、20151201；TLR2及NF-κB抗體購自于武漢山鷹生物技術(shù)有限責任公司，批號分別為20160514、20160121；硫化鈉購自蘇州博貿(mào)物資有限責任公司，批號為20160728。

1.3動物 從重慶醫(yī)科大學實驗動物中心選取體質(zhì)量在180～220 g間的雄性SD大鼠，無特定病原體(SPF)級，共72只，許可證編號SCXK(渝)2012-0001。

1.4主要儀器 O-lympus BX51顯微鏡及成像系統(tǒng)HITMAS-30購自于日本O-lympus公司儀器廠；SC-04型離心機購自安徽中科中佳科學儀器有限責任公司；移液槍購自德國Sigma公司。

1.5分組和造模 將用于實驗的所有大鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將72只大鼠分為正常組、模型組、對照組(阿司匹林，0.6 g/d)和活絡(luò)效靈丹組，每組12只。根據(jù)臨床一般用量，按照《中藥藥理研究方法學》[8]中提到的換算方法，再結(jié)合以往相關(guān)文獻報道[9]和預(yù)實驗結(jié)果，將活絡(luò)效靈丹組細分為低、中、高劑量組，劑量分別為15、30、45 g·kg-1·d-1。除正常組大鼠外，其余各組大鼠均建立急性軟組織損傷模型，建模方法簡要概括如下：建模前1 d，采用7%的硫化鈉對大鼠右大腿進行腿毛處理備用；建立模型時，先將大鼠固定于軟組織擊打器上，選擇大腿的軟組織位置，做好記號后，再用兩層棉布將大鼠右大腿覆蓋以保護皮膚不被砸破，隨后將準備好的砝碼(150 g)從50 cm高處自由落下，重復3次。按照以下方法驗證模型是否建立成功：造模后1 h，觀察被擊打大鼠右大腿內(nèi)側(cè)的肌肉組織，若皮下有出血點或瘀斑，局部皮膚未見破損，局部軟組織呈現(xiàn)腫脹，通過觸診觀察無骨折及脫位體征，蘇醒后大鼠患側(cè)肢體呈現(xiàn)跛行，滿足以上條件的大鼠則視為急性軟組織損傷模型建立成功[10]，可用于后續(xù)實驗研究。

1.6給藥方法 模型建立后，活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組大鼠每天分別給予相應(yīng)劑量的活絡(luò)效靈丹加減方，在固定時間點，通過灌胃方式給藥，3次/d；對照組大鼠每天給予阿司匹林進行治療，先將對應(yīng)劑量阿司匹林膠囊內(nèi)容物溶于與活絡(luò)效靈丹各劑量組等量的純化水中，再進行灌胃給藥，0.6 g·d-1·次-1；正常組和模型組大鼠均給予等量純化水。

1.7基本痛閾值檢測 恒溫水浴鍋的溫度設(shè)置為54 ℃，將容積1 000 mL的燒杯置于水浴鍋進行預(yù)熱，隨后取出1只大鼠，將其放入預(yù)熱的燒杯中，觀察并記錄每只大鼠雙足接觸燒杯底部后至發(fā)生第1次舔后足的時間，即為基礎(chǔ)痛閾，每只大鼠連續(xù)測定3次，取平均值[11]。

1.8血液流變學檢測 連續(xù)灌胃7 d后，除正常組大鼠外，其余各組大鼠均于下午給藥后1 h(約為下午6點),通過皮下注射方式給予1 mg/kg的腎上腺素注射液，給藥2 h后將大鼠放置進冰水中浸泡5 min后取出，2 h后再次皮下給予1 mg/kg的腎上腺素注射液，隨后禁食。第2天早晨8:00,腹腔注射40 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，通過腹主動脈取出5 mL全血，加肝素抗凝，最后用全自動清洗旋轉(zhuǎn)式血液粘度檢測儀對大鼠全血高切(150/s)、中切(60/s)、低切(10/s)、血漿粘度及紅細胞比容(HTC)進行檢測[8]。

1.9Western blot法檢測損傷部位組織中TLR2及NF-κB的表達 連續(xù)灌胃7 d后，處死大鼠，取各組大鼠損傷部位組織，按照如下方法檢測TLR2及NF-κB蛋白的表達：組織中加入裂解液進行裂解，收集蛋白樣品，用BCA法測定蛋白濃度，隨后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，具體實驗操作步驟結(jié)合說明書和參考文獻[12]進行，最后采用ECL試劑盒顯影、日本HITMAS-30系統(tǒng)成像。每組實驗均重復3次取均值。

1.10ELISA法檢測損傷部位組織中IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-10的表達 連續(xù)灌胃7 d后，處死大鼠，取各組大鼠損傷部位組織，進行勻漿后，再按照ELISA試劑盒說明書和參考文獻[13]的指示進行操作，檢測各組大鼠損傷部位IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-10的表達。

1.11檢測指標 損傷癥候指數(shù)測定：在灌胃給藥后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 6個時間點，觀察各組大鼠患側(cè)傷肢腫脹及瘀斑等相關(guān)癥候表現(xiàn)，并按照以下標準進行評分：(1) 皮下淤血程度：塊狀出血多記2分，點狀出血少記1分，無淤血記0分；(2)肌肉腫脹程度：明顯腫脹記2分，稍有腫脹記1分，無腫脹記0分；(3) 肌肉顏色情況：暗紫色記2分，淺暗紅色記1分，顏色正常記0分。基本痛閾值：分別測定第7天灌胃給藥前和給藥后30 min、1 h、2 h 4個時間點各組大鼠的基本痛閾值。血液流變學檢測：包括大鼠全血高切(150/s)、中切(60/s)、低切(10/s)、血漿粘度及HTC。損傷部位組織中TLR2、NF-κB、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-10的表達。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠損傷癥候指數(shù)檢測情況 觀察及評估結(jié)果顯示：(1)造模后，大鼠患側(cè)傷肢即刻出現(xiàn)腫脹、瘀斑等癥候，造模后1～2 d腫脹最為嚴重，隨后有所減輕，于第5天腫脹逐漸消退，但傷處仍可見瘀斑；(2)與模型組比較，對照組和活絡(luò)效靈丹組大鼠的損傷癥候指數(shù)在給藥后的第1、2、3、5、7天明顯降低(P<0.05)，見表1；(3)與對照組比較，活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠，消腫、祛瘀效果明顯更優(yōu)，特別是在給藥后的第5、7天(P<0.05)。

表1 各組大鼠損傷癥候指數(shù)檢測情況分，n=12)

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對照組比較；d:P<0.05，與活絡(luò)效靈丹低劑量組比較

表2 各組大鼠基本痛閾值檢測情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對照組比較；d:P<0.05，與活絡(luò)效靈丹低劑量組比較；e:P<0.05，與活絡(luò)效靈丹中劑量組比較

表3 各組大鼠血液流變學檢測情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對照組比較

2.2各組大鼠基本痛閾值檢測情況 給藥前，各組大鼠的基本痛閾值相似，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給藥后，活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠的基本痛閾值較模型組明顯升高，其中活絡(luò)效靈丹高劑量組升高最為顯著，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，活絡(luò)效靈丹中、高劑量組大鼠差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3各組大鼠血液流變學檢測情況 與正常組比較，模型組大鼠的全血粘度、血漿粘度和HTC均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，對照組和活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠以上指標均明顯下降(均P<0.05)；與對照組比較，活絡(luò)效靈丹中、高劑量組大鼠以上指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4各組大鼠損傷部位組織中TLR2、NF-κB表達情況 與正常組比較，模型組大鼠TLR2、NF-κB蛋白表達均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠TLR2、NF-κB蛋白表達均有明顯下降，其中，以高劑量組下降最為明顯(P<0.05)，而對照組兩種蛋白的變化較小(P>0.05)，見表4、圖1。

2.5各組大鼠損傷部位組織中IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-10的表達情況 與正常組比較，模型組大鼠IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表達均明顯升高，而IL-10的表達明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，對照組和活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠炎癥狀況均有改善(P<0.05)；與對照組比較，活絡(luò)效靈丹高劑量組大鼠以上指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表4 各組大鼠損傷部位組織中TLR2、NF-κB表達情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對照組比較

圖1 各組大鼠損傷部位組織中TLR2、NF-κB表達的Western blot圖

表5 各組大鼠損傷部位組織中炎癥細胞因子表達情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對照組比較

3 討 論

急性軟組織損傷是一種外來或內(nèi)在致病因素作用導致組織發(fā)生急性破壞、生理功能發(fā)生暫時紊亂而產(chǎn)生的損傷，在日常生活中比較常見，患者會產(chǎn)生一系列癥候表現(xiàn)，影響正常的工作生活。中醫(yī)認為其病因病機主要為“氣滯血瘀、脈絡(luò)不通”，認為其損傷之癥，多傷及氣血，傷氣則氣滯，氣滯則血淤，血淤致氣阻，從而導致血滯留于肌膚表面，使肌膚呈現(xiàn)腫痛和青紫色，故發(fā)生軟組織損傷后，主要表現(xiàn)為局部的瘀斑、腫脹、疼痛且活動受限[2]。臨床上也證明，很多中醫(yī)名方對急性軟組織損傷確有療效，但具體機制卻很模糊。本實驗研究主體藥物活絡(luò)效靈丹具有“抗炎、祛瘀、鎮(zhèn)痛”之效，可改善腫脹、淤青、疼痛等相關(guān)癥狀，本研究結(jié)果顯示：活絡(luò)效靈丹加減方可加快改善急性軟組織損傷大鼠患肢腫脹、瘀斑等癥候，提高基本痛閾值、行止痛之功效，還可明顯降低血液黏稠度、行活血散淤之功效，證實了活絡(luò)效靈丹加減方對急性軟組織損傷大鼠的療效。

現(xiàn)代醫(yī)學認為急性軟組織損傷發(fā)生時，主要表現(xiàn)為炎性因子的不斷釋放，因此，抑制炎性因子的釋放對急性軟組織損傷有重要意義。而炎性因子主要分為致炎因子及抗炎因子。前者可促進炎癥的發(fā)展進程，后者可抑制炎癥的發(fā)展進程，兩者共同作用于機體，其動態(tài)平衡可影響炎癥發(fā)生發(fā)展的結(jié)局及受損組織的康復。本研究中IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α屬于促炎因子。在復雜的炎性反應(yīng)中，IL-1β是整個炎癥持續(xù)進展中一直存在的炎性因子，它和TNF-α是眾多炎性因子中最先釋放分泌的促炎前因子，它們的分泌會刺激IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等其他促炎因子的釋放，從而形成瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)。IL-8因其敏感性較強，在炎癥局部組織中會大幅升高，故在炎癥疾病的診斷中，可作為診斷依據(jù)[14]。同時，IL-8還能特異性地趨化中性粒細胞侵入炎癥組織，促使脫顆粒釋放炎性介質(zhì)，并可激活巨噬細胞、單核細胞、淋巴細胞等炎性細胞，引起患者發(fā)熱，進一步促進炎癥的病理性損傷[15]。本研究實驗結(jié)果也顯示：模型組大鼠癥候嚴重，以上指標的表達顯著增多；活絡(luò)效靈丹則有效改善了相關(guān)癥候，降低了以上致炎因子的表達。本研究中的IL-10屬于抗炎因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10有很強大的抗炎活性和免疫抑制作用[16]，一方面，能夠一定程度抑制IL-2、IL-3、TNF-α等細胞因子的釋放，并與其他抗炎介質(zhì)具有協(xié)同作用[17]；另一方面，作為免疫調(diào)節(jié)因子，可限制、終止炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫細胞分化、增殖，從而防止發(fā)生過度免疫造成的損傷，并通過抑制其他炎癥細胞活化，減少促炎因子釋放，抑制炎癥發(fā)展[18]。本實驗結(jié)果也顯示模型組大鼠IL-10表達明顯降低，而活絡(luò)效靈丹則可促進IL-10的表達。

TIRs是新近發(fā)現(xiàn)的一類細胞表面受體，不僅對病原體有一定感知作用，可刺激細胞產(chǎn)生特異性免疫[19]，作為連接特異性、非特異性免疫的紐帶，當微生物突破機體屏障時，它還可以識別外物，激活機體，產(chǎn)生應(yīng)答，同時，TLRs介導的信號通路在炎癥進程中也起著重要的作用[20-21]，當TLRs激活后，可促使NF-κB等通路的活化，在TLRs/NF-κB通路中，TLR2、NF-κB作為兩個關(guān)鍵蛋白，對下游炎癥因子的釋放發(fā)揮了巨大的作用。抑制這兩個關(guān)鍵蛋白，可調(diào)控炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示活絡(luò)效靈丹加減方可抑制TLR2、NF-κB的表達。

綜上，活絡(luò)效靈丹加減方對大鼠急性軟組織損傷具有一定保護作用，該作用可能與抑制TLR2/NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)下游炎癥因子的表達有關(guān)。本研究首次從分子、細胞水平對活絡(luò)效靈丹發(fā)揮藥理效應(yīng)的機制做了初步探索，為其在臨床發(fā)揮更大價值奠定了基礎(chǔ)理論依據(jù)。但本研究仍存在一些不足：(1)炎性因子的調(diào)控是一張巨大的網(wǎng)絡(luò)，通路錯綜復雜，相互影響，相互制約，本研究只是進行了初步探索，證明活絡(luò)效靈丹的作用可能與此通路有關(guān)，但不能直接下定論；(2)由于本研究的研究重點為通過建立大鼠急性軟組織損傷模型驗證該方療效，并對其可能機制進行初步探索，但并沒有專門對活絡(luò)效靈丹低、中、高3個劑量組進行兩兩比較。在統(tǒng)計方法上選用的SNK法和Dunnet′t法，但因涉及多時間點測量數(shù)據(jù)組間比較采用的是重復測量方差分析法，該方法得出的結(jié)果自帶有活絡(luò)效靈丹低、中、高3個劑量組之間的比較，筆者也發(fā)現(xiàn)了在某些時間點，活絡(luò)效靈丹低、高劑量組之間存在統(tǒng)計學差異。故在后期，本課題組會考慮加入針對此通路的拮抗劑，進一步深入探索。