金蟬花多糖對四氯化碳誘導小鼠肝纖維化的治療作用及其機制研究*

2019-09-16 01:38:22陳盛鐸王家瑞梁海莉

重慶醫學 2019年16期

溫萍,陳盛鐸,王家瑞,車巍,鄭兵,梁海莉

(湖北省中醫院花園山院區肝病科,武漢 430061)

肝纖維化是因肝炎病毒、乙醇、毒素等引起免疫炎性損傷誘發的慢性漸變型疾病病理變化，以不可逆細胞外基質堆積引起肝臟組織重塑為主要病理特點[1]。臨床數據顯示，多種慢性肝臟疾病常在發病早期不可反轉、反復刺激損傷時，最終發展成纖維化病理變化，進而引發肝功能喪失，威脅生命，而及時的干預可有效抑制纖維化的發生發展[2]。然而，目前以抗有絲分裂藥物秋水仙堿為主的抗纖維化藥物因為其無限制性的細胞毒作用在臨床應用中受限[3]。同時，研究證實，在肝纖維化發生發展過程中，以轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)為主的由多種免疫細胞和肝細胞合成分泌的炎性相關細胞因子參與調節纖維化病程，促使炎性反應向纖維化形態轉化[3-4]。且免疫調節劑在纖維化臨床干預治療中具有良好的應用前景[5]。

傳統中草藥金蟬花(cordyceps cicadae)中提取的金蟬花多糖(cicadas polysaccharides)具有提高機體免疫力的功能，可在體外同時激活T淋巴細胞和B淋巴細胞，并促進其增殖[6]。同時，其可有效減少腎臟細胞外基質的合成，抑制腎纖維化[7]。金蟬花多糖安全性高，對正常細胞影響小[8]，因而，金蟬花多糖在纖維化治療中具有廣闊前景。然而，目前對金蟬花多糖的作用效應及其機制尚不明確[8-9]。因此，本研究擬觀察金蟬花多糖對皮下注射四氯化碳誘導小鼠急性肝纖維化的保護作用，并探討其對Tregs的影響，為金蟬花多糖在臨床應用于急性肝纖維化提供實驗研究依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥物金蟬花多糖為陜西斯諾特生物技術有限公司產品，含量65%，中國藥典CP2010，貨號snt3688。實驗前用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成200 mg/mL溶液。秋水仙堿為西雙版納州醫藥有限責任公司產品，中國藥典CP2010，國藥準字H53021369。實驗前PBS配制成0.01 mg/mL溶液。

1.1.2動物和分組無特定病原體(SPF)級C57BL/6雄性小鼠90只(華中科技大學同濟醫學院動物醫學中心，動物許可證號SCXK20150012)，依體質量均衡分組為：正常組，模型組，秋水仙堿組(0.1 mg/kg)和金蟬花多糖低劑量(0.5 mg/kg)、中劑量(1.0 mg/kg)和高劑量(2.0 mg/kg)組，每組15只。由于四氯化碳模型毒性高，致死性高(雖然本實驗中動物死亡較少)，其模型個別出現狀態較差，可能致使個別四氯化碳模型小鼠在給予干預后無明顯的變化，雖然總體統計有顯著性差異，但動物實驗差異大，因此在保證數據結果符合最初統計分析的基礎上，對個別小鼠數據進行剔除，均保留10只小鼠作為最終數據展示。

1.1.3試劑四氯化碳購自德州潤昕實驗儀器有限公司，Masson染液購自武漢塞維爾生物技術有限公司，小鼠血漿丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和組織羥脯氨酸水平檢測試劑盒購自天津碧云天生物技術有限公司，小鼠γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、轉化生長因子-β(TGF-β)和α-肌動蛋白(α-SMA)ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司，小鼠單核淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，小鼠CD4-別藻藍蛋白(APC)和CD25-異硫氰酸熒光素(FITC)流式抗體購自北京BioLegend公司。

1.1.4儀器正置熒光顯微鏡和相差顯微鏡(日本 Olymics公司)；低溫高速離心機(德國Thermo Fisher公司);C6流式細胞儀(美國BD公司)；多功能酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立與給藥模型組、秋水仙堿組和金蟬花多糖組通過皮下注射四氯化碳(1.0 mg/kg)建立小鼠肝纖維化模型，每周2次，共7周。正常組同時給予橄欖油。隨后，秋水仙堿組灌胃給予秋水仙堿溶液300 μL，各金蟬花多糖組灌胃均給予金蟬花多糖300 μL，2次/d，共3周。期間小鼠自由飲食。

1.2.2體質量、存活率和肝指數分析實驗期間，記錄小鼠體質量，分析給藥前后小鼠體質量變化，并于實驗結束后，處死小鼠去除肝臟，稱質量后計算肝指數，公式為：肝指數=肝臟濕質量(mg)/體質量(g)。

1.2.3羥脯氨酸水平檢測稱取各組小鼠肝臟100 mg，加入濃鹽酸后高壓溶解，并用1 mol/L NaOH調節pH=7.0。采用氯胺-T法檢測羥脯氨酸水平，于560 nm檢測吸光度(A)值，以每克肝組織中羥脯氨酸含量表示(μg/g)。

1.2.4組織病理學檢測各組小鼠肝組織置于4%多聚甲醛溶液中48 h，常規石蠟包埋并5 μm切片后，進行Masson染色。膠原沉積程度用Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

1.2.5外周血ALT、AST水平檢測眼球取血800 μL于肝素鈉抗凝采血管中，分取100 μL后3 000 r/min離心取血漿，吸取50 μL置于玻璃試管中，按照試劑盒說明檢測血漿ALT和AST水平。

1.2.6外周血IFN-γ、IL-4和TGF-β水平檢測取100 μL新鮮分離的血漿，按照ELISA試劑盒說明，檢測肝組織勻漿液中IFN-γ、IL-4和TGF-β的水平。

1.2.6肝組織α-SMA、Ⅰ型膠原、TGF-β mRNA水平檢測采用TRIzol一步法提取100 mg肝組織總RNA，并使用NanoDrop2000對RNA濃度和純度進行檢測。參照逆轉錄試劑盒(美國Thermo fisher公司)操作步驟說明將500 ng總RNA反轉錄為cDNA。以TE溶液稀釋cDNA至10 ng/μL，按照RT-qPCR說明，取10 ng cDNA作為反應模版，15 μL PCR反應體系，反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35次；72 ℃終延伸5 min。擴增結束后制作融解曲線，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，計算α-SMA、Ⅰ型膠原和TGF-β mRNA水平。引物序列:TGF-β，正向5′-AAA ATC AAG TGT GGA GCA AC-3′，反向5′-CCA CGT GGA GTT TGT TAT CT-3′，擴增產物大小 224 bp；α-SMA，正向5′-ATC TGG CAC CAC TCT TTC TA-3′，反向5′-GTA CGT CCA GAG GCA TAG AG-3′，擴增產物大小191 bp；Ⅰ型膠原，正向5′-GCT CCT CTT AGG GGC CAC T-3′，反向5′-CCA CGT CTC ACC ATT GGG G-3′，擴增產物大小103 bp；GAPDH，正向5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，反向5′-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3′，擴增產物大小123 bp。

1.2.7外周血Tregs比例分析取加入400 μL單核淋巴細胞分離液的流式管，傾斜緩慢加入400 μL抗凝血于流式管中，3 000 r/min離心取中間單核淋巴細胞層于新流式管中，PBS洗2次后，以400 μL PBS重懸，每100微升分為4管，分別加入PBS、CD4-APC、CD25-FITC和CD4-APC與CD25-FITC流式抗體各2 μL。室溫避光孵育30 min，PBS洗2次后，以100 μL PBS重懸，上機檢測。

2 結果

2.1金蟬花多糖對四氯化碳誘導肝纖維化小鼠體質量和存活率的影響在給予四氯化碳7周時，模型組小鼠體質量明顯低于正常組,差異有統計學意義(P<0.05)；灌胃至10周，模型組體質量明顯低于秋水仙堿組、金蟬花多糖中劑量、金蟬花多糖高劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體質量變化情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較

A:正常組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：金蟬花多糖低劑量組；E：金蟬花多糖中劑量組；F：金蟬花多糖高劑量組

圖1金蟬花多糖對四氯化碳誘導肝纖維化小鼠肝組織形態和病理特征的影響(×100)

2.2金蟬花多糖對四氯化碳誘導肝纖維化小鼠肝指數和組織重構的影響模型組肝指數明顯高于正常組。通過Masson染色發現，模型組肝組織切片的藍色膠原沉積(黑色箭頭所指)面積，即纖維化比例較正常組更大，差異有統計學意義(P<0.05)。金蟬花多糖低、中、高劑量組肝指數均明顯低于模型組(P<0.05)，金蟬花多糖中、高劑量組纖維化比例明顯低于模型組(P<0.05)，差異有統計學意義；與秋水仙堿組相比，金蟬花多糖中、高劑量組肝指數及纖維化比例明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。