siRNA沉默ARC對低氧下大鼠肺動脈平滑肌細胞活力的影響*

張 婕，金 泉，吳素玲，管 明

(1.浙江省杭州市兒童醫院內二科 310014；2.浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院耳鼻喉科 310006)

低氧性肺動脈高壓是一種慢性進行性疾病，其中低氧是該病發生的最主要原因。肺動脈血管收縮、肺血管重構及微血管損傷是低氧性肺動脈高壓的主要發病機制[1-2]。肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)是肺動脈壁的主要構成細胞。PASMCs的增殖和凋亡平衡影響肺血管的厚度，是肺血管重塑的主要機制之一[3]。研究低氧性肺動脈高壓的發病機制，尋找更有效安全的治療方法一直是研究的熱點。

含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with caspase recruitment domain,ARC)是一種高效及多功能的調節內外源性凋亡的抗凋亡蛋白[4]。ARC可以拮抗由細胞毒性藥物、放射性損傷、氧化應激反應、缺氧、細胞內Ca2+平衡失調、內質網應激等引起的凋亡[5]。由于ARC對于PASMCs生長與肺血管重塑的影響并不明確，本研究主要通過干擾ARC的表達，探討是否影響下游反應元件的激活，最終通過一系列內外源性抗凋亡因子的表達，使得機體適應外界環境的變化。因此，本研究通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術，體外干擾PASMCs ARC的表達，檢測細胞活力變化，討論ARC在PASMCs生長中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑 胎牛血清、DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液購于美國HyClone公司；OPTI-MEM購于美國Gibco公司;青、鏈霉素(100×)購于上海碧云天生物技術公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購于美國Thermo Fisher Scientific公司；Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購于(H+L)索萊寶公司；FITC標記山羊抗兔IgG購于美國BD公司； BCA蛋白定量試劑盒購于南京維森特生物技術公司；吐溫20(Tween-20)購于上海生工生物工程公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Millipore公司；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體、β-actin抗體、ARC抗體購于美國Santa Cruz公司;CCK-8購于北京普魯頓公司。

1.2方法

1.2.1大鼠PASMCs的分離、培養及分組 大鼠PASMCs的培養和鑒定采用膠原酶Ⅰ消化法[9]。取SD大鼠，超凈臺內處死，取肺組織，分離肺內動脈血管于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。分離出血管中膜，用眼科剪將血管中膜剪碎，放入預先盛有含0.2%膠原酶Ⅰ的離心管中離心，棄上清液后將沉淀組織重懸于5 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，取細胞懸液，置于培養皿中于培養箱中孵育。一般約1周平滑肌細胞可從組織塊中爬出，待細胞即將融合時，進行消化傳代，取2～3代細胞進行實驗。將PASMCs分成以下4組：常氧組、低氧組、ARC-siRNA+低氧組、Negative-siRNA+低氧組。

1.2.2免疫熒光染色法檢測ARC、caspase-3表達 將生長狀態良好的PASMCs細胞接種至12孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜后，棄去培養基。取細胞PBS洗滌1次，多聚甲醛固定細胞，室溫孵育10 min。PBS洗滌3次，加入含0.2% TritonX-100,室溫靜置30 min。PBS洗滌3次，加入約40 μL一抗(ARC 1∶1 000、caspase-3 1∶1 000、α-SMA 1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜。除去未結合的一抗，PBS洗滌后加入二抗，靜置 30 min， PBS洗滌。隨后用DAPI染核5 min，PBS洗滌，用尖鑷子將玻片取出，晾干，載玻片上滴一滴封片液。熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.3siRNA轉染細胞 PASMCs接種于6孔板中，待細胞長至70%融合時，棄培養基，用PBS洗3次，無血清培養基洗2次，加入新的無血清培養基，將Lipofectamine2000、ARC-siRNA(ARC-siRNA 1、2、3)或陰性對照序列(Neigative-siRNA)分別加入細胞中，充分混勻，培養48 h后，換液，進行后續實驗。ARC的3個siRNA oligo序列見表1。

表1 各siRNA序列

1.2.4CCK-8法檢測細胞活力 收集細胞，將轉染48 h的細胞用胰蛋白酶-EDTA消化，稀釋細胞使其濃度為3×107/L。分別取100 μL于96孔板培養，每組設3個復孔，常氧培養過夜貼壁。在常氧或低氧條件下將各組細胞分別培養 0、24、48、72 h后，按1∶10體積比混合CCK-8和無血清DMEM培養基，取100 μL加入待測孔中，37 ℃、5% CO2孵育1 h；用微板分光光度計測定450 nm波長下的吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.2.5Western blot 收集各組細胞，加入細胞裂解液，在冰上靜置裂解20 min；4 ℃ 10 000×g 離心5 min,取上清液，加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠上樣緩沖液水浴(100 ℃)變性10 min，樣本備用或分裝凍存。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，100 V轉移至PDVF膜，封閉液中封閉1 h；加入一抗[分別為ARC抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶500)]室溫孵育2 h；洗膜；放入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG室溫孵育1 h；PBST洗膜，在暗室中加ECL發光試劑，X射線膠片曝光1～2 min后顯影、定影，雜交信號在圖像分析系統中進行光密度掃描。應用管家基因β-actin作為內參，其余目的蛋白與其的比值對目的蛋白相對表達水平。實驗重復3次。

表2 各基因RT-PCR引物

1.2.6RT-PCR TRIzol一步法提取各組細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書步驟，合成cDNA。紫外吸收法測定總RNA在260 nm和280 nm處A值，計算其濃度和純度。用PCR擴增目的片段。以GADPH mRNA表達水平作為內參。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，循環35次。PCR產物在1.5%～1.8%的瓊脂糖凝膠上電泳，條帶經紫外顯色灰度掃描。各基因RT-PCR引物見表2。實驗重復3次。

2 結 果

2.1siRNA在PSCMCs中抑制ARC表達的效率檢測 常氧下，免疫熒光染色發現ARC在PSCMCs的細胞核和細胞質內均存在表達，見圖1。常氧下，ARC-siRNA干擾后，ARC在PSCMCs中的表達水平經RT-qPCR檢測，結果顯示：相對于對照細胞(未轉染siRNA，常氧，ARC表達水平設為100%),ARC-siRNA1,ARC-siRNA2,ARC-siRNA3作用后，ARC mRNA的表達水平分別為(46.8±3.0)%、(42.6±6.9)%、(50.7±10.0)%，其中ARC-siRNA 2抑制ARC表達的效率最高 (圖2A)。Western blot、免疫熒光染色檢測ARC-siRNA2干擾，ARC在PSCMCs的表達水平，結果發現ARC在ARC-siRNA2干擾后的細胞中表達較對照細胞顯著下降(圖2B、C)。因此最終選取ARC-siRNA2來進行后續實驗。

圖1 ARC在PACMCs中表達(熒光顯微鏡×800)

A:ARC mRNA表達量被ARC-siRNA1、ARC-siRNA2、ARC-siRNA3轉染后所抑制;B:Western blot結果顯示 ARC表達水平在ARC-siRNA2干擾后顯著下降;C:免疫熒光結果顯示ARC表達水平在ARC-siRNA2干擾后顯著下降。a:P<0.05

圖2ARC-siRNA抑制ARC在PASMCs中的表達(熒光顯微鏡×400)

2.2ARC對低氧下PASMCs細胞活力的影響 CCK-8法檢測細胞活力結果顯示低氧明顯促進PASMCs活力(P<0.01)，且呈時間依賴性，各組在0 h時A值差異無統計學意義(P>0.05)。在低氧情況下，ARC-siRNA+低氧組的A值較Negative-siRNA+低氧組明顯減弱，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3低氧下PASMCs中caspase-3表達水平變化及與ARC的關系 為了進一步研究ARC對低氧下PASMCs活力影響的機制，筆者采用免疫熒光染色檢測了caspase-3在低氧作用后表達水平變化。免疫熒光染色結果顯示，低氧作用48 h，低氧組caspase-3陽性細胞較常氧組顯著增加[(22.4±5.2)%vs.(5.5±1.8)%]。用ARC-siRNA下調ARC表達，再低氧作用48 h，免疫熒光染色結果顯示ARC-siRNA組與Negative-siRNA組比較，caspase-3陽性細胞顯著增加[(50.1±5.8)%vs. (17.2±4.1)%]。結果表明，ARC干擾后，PASMCs對低氧敏感度增加，可能與caspase-3表達增加有關。見圖3。

表3 CCK-8法測量不同分組下PASMCs細胞活力情況值)

a：P<0.05,與常氧組比較；b:P<0.05，與Negative-siRNA+低氧組比較

圖3 ARC表達抑制后低氧條件下PASMCs中caspase-3表達水平變化(熒光顯微鏡×800)

2.4低氧下PASMCs凋亡通路中多種凋亡因子表達水平及與ARC的關系 低氧作用48 h后，低氧組caspase-3 mRNA表達水平較常氧組顯著增加，且內源性促凋亡因子Bad、 Fadd表達顯著增加，抗凋亡因子Bcl-2表達顯著下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。ARC-siRNA+低氧組與Negative-siRNA+低氧組比較，caspase-3和Fadd表達均顯著增加，Bcl-2表達則顯著下降(P<0.05)，而Bad表達無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

a：P<0.05,與常氧組比較；b:P<0.05 ，與Negative-siRNA+低氧組比較

圖4ARC表達抑制后低氧條件下凋亡因子表達水平變化

3 討 論

低氧性肺動脈高壓是由低氧血癥引起的肺動脈壓力升高，是一種慢性進行性疾病，其主要病理特征為肺動脈壓力持續增高、肺動脈壁的增厚及血管肌化，目前其治療手段和效果有限，預后極差，常導致患者右心心力衰竭而死亡[1]。其中低氧是該病發生的最主要原因。肺動脈血管收縮、肺血管重構及微血管損傷是低氧性肺動脈高壓的主要發病機制[2]。低氧性肺血管重建是低氧性肺動脈高壓的主要病理改變，PASMCs是構成肺動脈壁的主要細胞，PASMCs增殖和凋亡失衡是肺血管重塑的主要機制，而細胞活力的變化能從側面說明反映細胞增殖凋亡情況。

ARC是1998由KOSEKI等[4]首次發現并命名是一種高效及多功能的調節內外源性凋亡途徑的抗凋亡因子。ARC含有兩個功能區域：CARD和P/E，CARD區同凋亡因子caspase的CARDS區及凋亡受體蛋白RAIDD和Apaf-1具有同源性。ARC通過與caspase或其受體蛋白之間的相互作用來調節凋亡信號，維持其線粒體膜電位的穩定，抑制線粒體釋放活性氧[5]。在心肌細胞缺血再灌注模型中，ARC缺陷的小鼠，心肌細胞損傷更加顯著[6-7]。而過表達ARC可保護心肌因缺血再灌注引起的損傷[8-9]。ARC參與細胞程序性死亡、凋亡、遷移等行為的調控，維持線粒體膜電位的穩定[5,10-13]。

本研究發現ARC在PASMCs表達，對于低氧性肺動脈高壓研究顯示，低氧促進PASMCs活力，凋亡減少，增殖增加[14]，在肺血管重塑中發揮著重要作用，這與本研究的研究結果相符。本研究用轉染法將外源性siRNA導入PASMCs構建ARC干擾模型，在經過體外轉染PASMCs并做篩選后，選定轉染效率最好的靶點2(ARC-siRNA2)，采用免疫熒光來檢查轉染結果，結果顯示ARC表達顯著降低，說明轉染模型構建成功。研究結果顯示ARC對PASMCs活力可能具有一定的增強作用，低氧下PASMCs細胞活力較常氧下增加。低氧下，當ARC受到抑制時，細胞活力受抑制；本研究顯示這一結果可能與多種因子相互作用有關，當ARC表達被抑制時，促凋亡因子caspase-3和Fadd表達顯著增加，抗凋亡因子Bcl-2的表達降低，而促凋亡因子Bad無明顯變化。