線粒體鈣單向轉運體在小鼠心肌肥厚損傷中的作用*

王 晶，張 珍，曹雅男，滕艷杰△

(牡丹江醫學院:1.醫藥研究中心；2.第一臨床醫學院，黑龍江牡丹江 157011)

心血管疾病是全球死亡的常見原因之一,近年來我國心血管病疾病的患病率和病死率逐年上升，心血管病已成為我國居民的首位死亡原因[1]。有研究表明，心肌肥厚是導致心血管疾病發生率和病死率增高的獨立危險因子，是眾多心血管疾病的共同病理過程[2]，其發生機制尚未完全闡明，認為與細胞內Ca2+穩態失衡有密切關系。因此，抑制心肌肥厚對改善心臟損傷極其重要。線粒體是心肌細胞能量的來源，在細胞內鈣的調節中起重要作用[3-4]。國外最新的研究結果表明，線粒體鈣單向轉運體(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是線粒體內膜上的一個蛋白復合體，其成分由MCU、MCUb、MICU1 MICU2及EMRE構成[5-6]，能夠介導Ca2+從細胞質進入到線粒體基質，在細胞內Ca2+信號轉導、Ca2+穩態、線粒體能量代謝和細胞凋亡通路方面具有重要意義。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)是β受體激動劑，可以通過激活MAPK信號通路導致心肌肥厚，與手術造模方法相比較，皮下注射ISO對小鼠損傷小，動物模型成功率高，同時也更加簡單、經濟、可靠[7]。目前，MCU對心肌肥厚的作用研究多是通過體外實驗得到的結果，而在人體或動物體內MCU的作用研究較少，本實驗旨在小鼠探討MCU基因敲除對ISO誘導心肌肥厚損傷的影響，為MCU在心肌肥厚損傷中發揮保護作用提供更多的理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 ISO(上海阿拉丁公司)；生理鹽水、Masson染色試劑盒(南京建成試劑公司)；RNA提取試劑盒(美國Omega試劑公司)；反轉錄試劑盒(美國Roche公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑(北京中生瑞泰公司)；Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9-PCR引物(上海生工生物工程公司)；熒光定量PCR儀、S100 PCR自動系列化分析儀及Molecular Imager 凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組與處理 無特定病原體(SPF)級雄性CD1野生型小鼠及MCU基因敲除小鼠各16只，體質量(30±5)g，鼠齡12周，由中國軍事醫學科學院潘欣博士后贈送，動物許可證號:SCXK(軍)2012-0004。按照體質量分為4組，每組8只。分別為正常對照組、野生造模組、敲除對照組和敲除造模組。參照文獻[7]方法操作，在禁食12 h后，根據體質量，造模組小鼠皮下注射ISO 5 mg/kg，每天早晚各注射1次，間隔12 h，對照組小鼠以等容積的生理鹽水進行皮下注射，各組連續注射14 d。試驗結束后，采用頸椎脫臼法將小鼠處死，取心臟和肺稱質量并記錄。隨后將小鼠各組部分心臟的心房切掉，然后再分離左心室和右心室，將分離的左心室裝入1.5 mL的EP管中并放在液氮中保存，最后按順序放入指定的盒子里并放入-80 ℃冰箱冷凍；各組另一部分小鼠的心臟放入裝有4%多聚甲醛溶液的5 mL EP管中固定，等待組織包埋。

1.2.2心質量/體質量比(HW/BW)、肺質量/體質量比(LW/BW)檢測 據測量的小鼠心質量、肺質量及體質量，計算HW/BW、LW/BW。

1.2.3實時熒光定量PCR 用RNA提取試劑盒提取各組小鼠心肌組織總RNA，反轉錄成cDNA。PCR反應體系包括cDNA 2.0 μL、SYBR Green Mix 9.0 μL、引物各0.8 μL和超純水7.4 μL，總體積20.0 μL。PCR反應擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s,共40個循環。計算Ct 值、 2-△△Ct值 。以β-actin為內參,引物序列如表1。

表1 PCR擴增引物序列

1.2.4HE染色 將多聚甲醛固定的心臟組織常規脫水，透明，石蠟包埋，用feica旋轉式切片機切片，厚度4 μm，行HE染色。步驟如下，65 ℃ 烘片4 h。將石蠟切片放入二甲苯溶液中，浸泡6 min后取出，再放入另1個二甲苯溶液中浸泡6 min。乙醇水化，蘇木素染劑浸泡10 min，鹽酸乙醇溶液浸泡3 s，蒸餾水稍洗20 s，0.04% 氨水溶液返藍30 s，伊紅染色，自來水沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.5心肌纖維化的檢測 同1.5切片，進行Masson染色。步驟如下，65 ℃ 烘片4 h。將石蠟切片放入二甲苯溶液中，浸泡6 min后，再放入另1個二甲苯溶液中浸泡6 min。切片放入 Bouin 液，然后放入37 ℃的溫箱內2 h ，取出后用蒸餾水沖洗，至切片上的黃色消失。青石藍染色液滴染2 min后，自來水沖洗。蘇木素染色液滴染 2 min后，自來水沖洗。酸性乙醇分化20 s后，蒸餾水沖洗10 min。麗春紅滴染10 min，蒸餾水沖洗。磷鉬酸溶液處理10 min，直接滴入苯胺藍染色5 min。將切片用弱酸溶液處理 2 min,95% 乙醇快速脫水,100% 乙醇溶液反復浸泡3次，每次10 s，二甲苯溶液反復浸泡3次，每次2 min，最后中性樹脂封片。

2 結 果

2.1ISO誘導的心肌肥厚模型的鑒定

2.1.1小鼠HW/BW和LW/BW的改變 與各自對應的對照組比較，兩造模組小鼠HW/BW、LW/BW均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與野生造模組比較，敲除造模組小鼠HW/BW、LW/BW明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

2.1.2小鼠心肌肥厚標志物表達的改變 與各自對應的對照組比較，兩造模組小鼠ANP、BNP mRNA的表達均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與野生造模組比較，敲除造模組小鼠ANP、BNP mRNA表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.1.3小鼠心肌組織形態學的改變 正常對照組小鼠心肌組織心肌肌原纖維細胞排列整齊、致密、形態完整，細胞核及核仁結構清晰；野生造模組小鼠肌絲排列紊亂、松散心肌細胞體積明顯增大，形態不規整，細胞核深染、增大、畸形，核仁模糊；與野生造模組比較，敲除造模組小鼠心肌組織病理改變更為明顯，見圖3。

2.2MCU基因敲除對ISO誘導小鼠心肌肥厚心肌纖維化的影響 正常對照組小鼠心肌組織膠原分布均勻，相鄰的膠原纖維網完好，膠原纖維的含量少；野生造模組心肌內膠原纖維明顯增多，膠原纖維網斷裂，排列紊亂；與野生造模組比較，敲除造模組小鼠心肌纖維化面積明顯增加。見圖4。

A:LW/BW;B:HW/BW;a：P<0.05，b：P<0.01

圖1ISO對HW/BW和LW/BW的影響

A:ANP;B:BNP;a：P<0.05

圖2ISO對小鼠心肌肥厚標志物表達影響

2.3MCU基因敲除對ISO誘導小鼠心肌肥厚凋亡相關基因表達的影響 與各自對應的對照組比較，兩造模組小鼠Bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表達明顯升高，Bcl-2的表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與野生造模組比較，敲除造模組小鼠Bax、caspase-3、caspase-9的表達明顯升高，Bcl-2的表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

A：正常對照組；B：野生造模組；C：敲除對照組；D：敲除造模組

圖3MCU基因敲除ISO誘導的小鼠心肌胞厚心肌組織形態學的影響(HE×100)

A：正常對照組；B：野生造模組；C：敲除對照組；D：敲除造模組

圖4MCU基因敲除對ISO誘導小鼠心肌肥厚心肌纖維化的影響 (Masson×100)

A:Bax;B:Bcl-2;C:caspase-3;D:caspase-9；a:P<0.05；bP<0.01

圖5MCU基因敲除對ISO誘導小鼠心肌肥厚凋亡相關基因表達的影響

3 討 論

心肌肥厚是各種生理或病理刺激下心臟的適應性反應，但是，慢性心肌肥厚會使心臟功能逐漸減退，并最終發展為心律失常、心力衰竭，甚至猝死[8]。隨著分子生物學時代的到來，心肌肥厚在基因水平上研究的不斷深入，多個基因被發現在心肌肥厚中發揮重要作用[9]。小鼠心肌肥厚模型的構建主要有手術和藥物兩種方式，手術方式死亡率高、效率低，藥物方法更為簡單、方便。ISO是兒茶酚胺類β腎上腺素受體激動藥之一，半衰期相對較長，能更真實的模擬自然病程，而且皮下注射ISO也更為簡單、經濟。研究表明，交感神經系統的過度興奮，主要的原因是通過增加壓力/容量負荷而誘導心肌肥厚的發生發展。而在構建心肌肥厚的動物模型中也證明了這一點，使小鼠的交感神經系統興奮也成為構建小鼠心肌肥厚模型的主要方法[7,10-11]。

MCU基因敲除小鼠，除體形上較野生型小鼠小表型上與野生型小鼠幾乎沒有變化。基礎代謝方面MCU敲除小鼠同野生型小鼠一樣。在離體心臟缺血-再灌注損傷中，MCU敲除小鼠與野生型小鼠比較，梗死面積無差異，且功能損傷也無差異；但在骨骼肌上，表現為產能的缺陷[12]。隨后的研究表明野生型小鼠和MCU基因敲除小鼠心功能在靜息和應激情況下，二者心功能正常[13]。但近年來也有報道顯示，在心肌細胞中，敲除MCU基因，可增加MCU復合體的活性，促進心肌細胞凋亡，降低心肌功能[14-15]。

本實驗結果顯示，模型組小鼠HW/BW、LW/BW明顯增加，ANP、BNP mRNA的表達升高，HE染色出現肌絲排列紊亂、形態不規整，證實本實驗ISO誘導心肌肥厚造模成功。實驗中，經ISO干預后，MCU基因敲除小鼠HW/BW、LW/BW較敲對照組增加，ANP、BNP mRNA的表達較敲除對照組均顯著升高；Masson染色出現心肌組織纖維化病變，膠原沉積顯著；與各自對照組比較，兩模型組Bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表達均上調，Bcl-2的表達下降，而與野生造模組比較，敲除造模組以上變化更明顯。提示MCU基因敲除可加重ISO誘導的心肌肥厚損傷，使心肌纖維化面積增加，并促進心肌細胞凋亡，說明MCU具有保護心肌的作用。