外源褪黑素對低溫脅迫下油菜幼苗抗寒性的影響

史中飛,梁娟紅,張小花,成宏斌,鄭 晟,王 娟,張騰國

(西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730070)

植物在自然環境中生長會受到各種非生物脅迫的影響。在植物應對低溫脅迫的過程中可以發生多種生理代謝和生化分子的變化，如過氧化氫、超氧陰離子和羥自由基等活性氧(ROS)的大量積累，而ROS的積累能夠導致脂質的過氧化和細胞內蛋白質的氧化，抑制植物的正常生長發育[1]。因此，植物為了防止ROS引起的氧化損傷，進化出一系列復雜的抗氧化系統，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶系統和谷胱甘肽、脯氨酸等非酶抗氧化劑，它們可以直接參與ROS的反應，也可作為酶的反應底物，參與ROS信號誘導的其他反應[2]。

植物為了應對各種非生物脅迫，也進化出了一系列復雜的調控機制，包括蛋白磷酸化激酶的激活，如絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPKs)和鈣依賴性蛋白激酶(CDPKs)的磷酸化激活，參與植物對各種非生物脅迫的響應。MAPK級聯途徑由三種連續作用的蛋白激酶組成：即MAPKK激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK)和MAPK。當細胞外刺激被胞膜受體識別，MAPKKK首先被磷酸化激活，然后MAPKKK磷酸化激活MAPKK，MAPKK近一步使MAPK磷酸化激活，活化的MAPK可以與其他信號分子相互作用并激活特定的下游靶標，例如轉錄因子和其他功能性蛋白質，導致信號的響應[ 3]。越來越多的研究表明，MAPK級聯途徑在植物響應干旱、鹽、低溫等非生物脅迫方面起不可或缺的調節作用。在擬南芥中，研究最多的MAPKs包括AtMAPK3、AtMAPK4和AtMAPK6，受低溫、鹽和機械損傷的誘導[4]。水稻中，OsMKK6和OsMPK3能構成中度低溫信號傳導途徑并調節水稻對冷脅迫的耐受性；過表達OsMAPK5株系表現出OsMAPK5激酶活性和對干旱、鹽、冷脅迫的耐受性增加，表明OsMAPK5基因可以正向調節水稻對干旱、鹽和低溫的耐受性[6]。棉花的研究表明，GhMPK2的過表達降低了ABA的敏感性，增強了轉基因煙草植株對鹽和干旱脅迫的耐受性[7]。

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺，Melatonin，MT)是一種吲哚類色胺，是由松果體合成的一種小分子激素，廣泛存在于動物和人體內，1993年首次在日本牽牛花(Pharbitisnil)中被發現[8]，隨著人們不斷地研究表明，褪黑素也普遍存在于其它高等植物之中，并在植物生長、發育中具有多種生理功能，如調節晝夜節律、花形態發育、促進葉綠素合成和提高植物的光合作用等[9]。植物中褪黑素的另一主要功能是充當活性氧(ROS)清除劑，作為抵御植物內部和環境氧化應激的第一道防線[10]，研究表明，外源施用或內源誘導的褪黑激素能夠增強植物對鹽、寒冷、干旱等非生物脅迫的抗性，并能延緩葉片衰老[11]。趙小紅[12]等對黃瓜的研究表明，在低溫脅迫下，適宜濃度的外源MT處理能夠提高SOD、POD、CAT的活性和脯氨酸的含量，降低相對電導率和MDA的含量，增強黃瓜幼苗的抗性，緩解低溫給黃瓜幼苗帶來的傷害。吳雪霞[13]等研究發現，外源MT能夠增強低溫脅迫下茄子幼苗的光合作用以及清除活性氧的能力，減緩低溫脅迫的危害，提高茄子幼苗對低溫脅迫的耐性；此外，對玉米[14]、菘藍[15]的研究也表明褪黑素具有緩解低溫冷害的作用，而在油菜(Brassicarapa)方面的研究鮮見報道。

我國北方寒旱區地域遼闊廣袤，但冬春低溫嚴寒，冬茬農作物越冬十分困難，油菜作為我國重要的油料作物，在北方地區推廣冬油菜種植不但可以增產油料，也可以增加北方冬季土地覆蓋率、改善生態環境等。本研究以白菜型冬油菜品種隴油6號為試驗材料，用100 μmol·L-1MT預處理后再進行4℃低溫處理不同的時間，研究其對丙二醛含量、相對電導率、葉綠素含量、ROS含量、抗氧化酶活性和MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達的影響，分析外源MT對低溫脅迫下油菜幼苗抗性的影響，為深入研究MT在植物中的生物學功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料培養與處理

白菜型冬油菜隴油6號種子由甘肅農業大學提供，將購自上海森科農業生物技術公司的進口丹麥品氏草炭土與蛭石按2∶1的比例攪拌混勻，裝入小四方花盆中，用含有0.05 g·L-1艾美樂殺蟲劑的1/8 MS營養液完全浸透，挑選顆粒飽滿且經1% NaClO消毒的隴油6號種子，播種到花盆中，每盆6～8粒，置于25℃恒溫、14 h/10 h(光照/黑暗)、250 μmol·m-2·s-1的光照培養室培養，培養30 d左右后進行以下實驗處理：(1)4℃低溫處理：挑選生長良好的油菜幼苗澆灌1/8 MS營養液預處理24 h后，轉入4℃低溫培養箱培養，并于不同時間點(0、12、24、36、48 h)取樣，測定相關生理指標，并取脅迫處理24 h的幼苗葉片提取總RNA，用于基因的表達分析；(2)褪黑素預處理后再低溫處理：用含有100 μmol·L-1MT的1/8 MS營養液預處理生長良好的油菜幼苗24 h后，在4℃低溫培養箱培養處理不同時間段(0、12 、24 、36 h和48 h)后測定生理指標，并取脅迫處理24 h的幼苗葉片提取總RNA，用于基因的表達分析；(3)對照(CK)：油菜幼苗澆灌等量1/8 MS營養液，25℃恒溫培養，單獨的MT處理：油菜幼苗澆灌等量含有100 μmol·L-1MT的1/8 MS營養液，25℃恒溫培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 生理指標的測定 丙二醛、相對電導率、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的測定均參照李合生[16]的方法，葉綠素含量采用直接浸提法[17]測定，每個指標做3個生物學重復。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達 提取實驗處理后隴油6號葉片的總RNA，反轉錄成cDNA后，以ActinF、ActinR為管家基因引物，MAPK3-F、MAPK3-R為MAPK3引物，MAPK4-F、MAPK4-R為MAPK4引物，MAPK5-F、MAPK5-R為MAPK5引物(表1)，依據TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒用25 μL反應體系進行定量檢測，每個樣品做3個重復。定量反應體系為：SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40次循環；55℃～95℃每30 s升高0.5℃，81個循環。每個樣品均重復3次，采用2-ΔCt法分析基因的相對表達量。

1.3 數據處理與分析

用SPSS 20.0軟件進行統計分析，Image J軟件計算染色面積分數和相對灰度分析，Oringin 9.0軟件作圖。

表1 實時熒光定量PCR引物

2 結果與分析

2.1 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜幼苗MDA含量的影響

由圖1可以看出，與對照(0 h)相比，單獨的低溫脅迫處理油菜幼苗不同時間(12、24、36、48 h)，油菜幼苗MDA含量呈先上升后下將的趨勢，但均高于對照；用褪黑素預處理后再進行低溫處理12、24、36、48 h，與單獨的低溫脅迫處理相比，MDA含量分別降低了14.3%、15.0%、17.2%和20.0%，表明褪黑素預處理能夠降低油菜幼苗MDA的含量，緩解低溫脅迫下油菜幼苗的膜脂過氧化作用。

2.2 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜幼苗相對電導率的影響

如圖2所示，低溫脅迫處理不同的時間，油菜幼苗相對電導率與對照(0 h)相比，呈先上升后下將的趨勢，但均高于對照；與單獨的4℃處理相比，用褪黑素預處理后再進行低溫處理(12、24、36、48 h)，油菜幼苗相對電導率分別降低11.5%、12.8%、16.2%、15.1%，且差異達到顯著水平，表明褪黑素預處理能夠抑制低溫脅迫下油菜幼苗相對電解質的滲漏。

2.3 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜幼苗葉綠素的影響

由圖3可以看出，與對照(0 h)相比，單獨的低溫脅迫處理下油菜幼苗的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均隨處理時間的增長呈下降趨勢；與單獨的4℃處理相比，用褪黑素預處理后再進行低溫處理(12、24、36、48 h)，其中葉綠素a分別增長5.2%、9.0%、18.7%、20.7%，葉綠素b分別增長4.6%、11.0%、15.5%、19.1%，總葉綠素分別增長5.0%、9.5%、17.6%、20.3%，表明外源褪黑素可以緩解低溫脅迫下葉綠素的降解。

注：同一處理時間不同字母表示兩種不同處理(4℃、4℃+MT)之間差異顯著(P<0.05)，下同。 Note: Different letters at the same processing time indicate significant difference (P<0.05) between the two different treatments (4℃,4℃+MT)， the same below.圖1 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜MDA含量的影響Fig.1 Effects of exogenous melatonin on MDA content in Brassica rapa under low temperature stress

2.4 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜幼苗活性氧(ROS)的影響

圖2 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜相對電導率的影響Fig.2 Effects of exogenous melatonin on relative conductivity in Brassica rapa under low temperature stress

圖3外源褪黑素對低溫脅迫下油菜葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of exogenous melatonin on chorophyll content in Brassica rapa under low temperature stress

A: NBT染色；B: DAB染色;C: NBT染色面積分數;D: DAB染色相對灰度 A: NBT staining;B: DAB staining;C: NBT staining area fraction;D: DAB staining relativegray圖4 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜活性養(ROS)的影響Fig.4 Effects of exogenous melatonin on ROS in Brassica rapa under low temperature stress

2.5 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖5可以看出，與對照相比，單獨的低溫脅迫處理不同的時間，油菜幼苗體內CAT、POD、SOD酶活性均呈先增加后降低的趨勢；與單獨的4℃脅迫處理相比，用褪黑素預處理后再進行不同時間的低溫脅迫處理(12、24、36、48 h),CAT的活性分別增加28.5%、23.1%、7.6%、13.1%，POD的活性分別增加36.0%、25.3%、5.9%、18.7%,SOD的活性分別增加14.6%、18.6%、9.1%、13.6%，表明褪黑素預處理能夠增強低溫脅迫下油菜幼苗CAT、POD、SOD酶的活性。

2.6 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達的影響

MAPK激酶級聯途徑在植物抵御非生物脅迫信號傳導過程中發揮著重要的作用，擬南芥中AtMAPK3、AtMAPK4和AtMAPK6基因表達受到逆境脅迫的誘導。為了探討MAP激酶級聯途徑是否參與油菜中褪黑素誘導的耐寒性過程，對油菜MAPK3、MAPK4、MAPK6在4℃、MT、4℃+MT處理24 h后的表達情況進行了分析，結果表明(圖6)，與照相比，低溫脅迫能夠誘導MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達上調，且MAPK3、MAPK6基因達到顯著水平，用褪黑素預處理后再進行低溫脅迫處理，MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達均高于單獨的低溫脅迫，表明MAPK3、MAPK4、MAPK6基因均能響應低溫脅迫，但MAPK3、MAPK6基因比MAPK4基因對低溫脅迫更敏感，外源使用褪黑素能夠誘導低溫脅迫下MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達上調，且不同基因的響應程度存在差異。

圖5 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of exogenous melatonin on antioxidant enzyme activity in Brassica rapa under low temperature stress

圖6 外源褪黑素對低溫脅迫下油菜MAPK3、MAPK4 和MAPK6基因表達的影響Fig.6 Effects of exogenous melatonin on the expression of MAPK3, MAPK4 and MAPK6 genes in Brassica rapa under low temperature stress

3 討 論

植物在逆境條件下生長，會導致膜脂過氧化和細胞膜結構完整性的損傷[20]。低溫脅迫下植物的防御機制包括生理反應、適應代謝和基因表達變化。有研究表明，白曼陀羅幼嫩花芽[21]和蘆薈[22]在4℃低溫脅迫下褪黑素含量增加，表明褪黑素可能參與植物對低溫脅迫的調節。丙二醛(MDA)是一種最主要的膜脂過氧化反應生成物，其含量的變化能反映出環境對于植物損害程度的大小及植物應對外界環境刺激的劇烈程度，受低溫脅迫的植物經常遭受膜損傷，因此可以通過電解質滲漏和MDA含量來反應植物受到的損害程度。潘紅艷等[15]的研究表明用適當濃度外源褪黑素處理的菘藍幼苗MDA含量顯著降低，減輕了植株膜脂過氧化程度。Garcia等[23]的研究顯示，褪黑素能夠對細胞質膜的流動性起到穩定效果，同時保持磷脂和蛋白質功能的完整性，在一定程度上增強了細胞的抵御能力。同時也有研究表明外源褪黑素處理的黃瓜胚軸中膜脂過氧化水平顯著降低[24]。此外，對甜瓜的研究表明外源褪黑素處理能提高低溫脅迫下甜瓜幼苗葉片葉綠素含量，減緩光合速率的迅速下降[25]。本研究中，用褪黑素預處理后再進行4℃低溫處理，油菜幼苗體內MDA含量、離子滲漏率的增加和葉綠素的含量均顯著低于單獨的低溫脅迫處理，這些結果表明，適宜濃度的外源褪黑素可以緩解低溫脅迫引起的細胞膜損傷和葉綠素的分解，增加油菜幼苗的抗寒性。

MAPK級聯途徑是將細胞外刺激信號在細胞內級聯放大的重要信號傳導途徑，據報道其參與擬南芥、水稻和番茄等多種植物對生物和非生物脅迫的反應[31]。有研究表明AtMAPK6能被低溫、干旱等多種非生物脅迫迅速激活[32]；H2S可以調節AtMPK4基因的表達，增加擬南芥對低溫脅迫的耐受性，從而更好地適應環境[3]；外源H2O2也能夠激活AtMPK3、AtMPK6基因的表達[33]，此外，褪黑素也能夠上調低溫應答基因COR15a、低溫環境耐受轉錄因子CAMTA1以及抗氧化基因ZAT10/ZAT12的表達[34]，證實了褪黑素的保護作用可能與MAPK級聯途徑相關。本研究中低溫脅迫下油菜幼苗MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達上調，且MAPK3、MAPK6基因達到顯著水平，而用褪黑素預處理后再進行低溫脅迫處理，MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達均高于單獨的低溫脅迫，但不同基因的上調程度存在差異，表明低溫脅迫下，MAPK3、MAPK4、MAPK6基因均能響應低溫脅迫，但MAPK3、MAPK6基因比MAPK4基因對低溫脅迫更敏感；而使用褪黑素能夠誘導低溫脅迫下MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達上調，且不同基因對褪黑素誘導的響應程度存在差異，表明褪黑素緩解低溫脅迫對油菜幼苗損傷的過程與MAP激酶級聯信號途徑有關，但是具體的調節機制還有待進一步研究。

4 結 論

本研究中，與單獨的4℃低溫脅迫處理相比，100 μmol·L-1外源褪黑素預處理后進行4℃低溫脅迫處理，油菜幼苗MDA含量、相對電導率和ROS含量均顯著低于單獨的低溫脅迫處理，葉綠素含量、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性均增加，且MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達上調，表明使用100 μmol·L-1外源MT預處油菜幼苗，可以有效降低低溫脅迫下MDA含量、電解質的滲漏和ROS積累，抑制葉綠素的降解，誘導MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表達上調，進而增強油菜幼苗的抗寒性，緩解低溫脅迫造成的氧化損傷。