鹽脅迫對向日葵幼苗生長及生理特性的影響

凌云鶴,周 瑤，景 兵,李春蓮,肖恩時,王中華

(西北農林科技大學農學院，陜西 楊凌 712100)

由于經濟和工業高速發展，土壤鹽漬化使大面積土壤資源難以利用，嚴重制約我國農林業生產發展和生態環境的改善，因此合理開發和利用大面積的鹽漬化土地，篩選耐鹽植物資源，改善鹽漬化土地生態環境成為我國農林業生產中的迫切任務。栽培向日葵(HelianthusannuusL.)屬菊科向日葵屬，雙子葉植物栽培種，起源于北美西南部[1]。其具有高產、出油率高，能耐受干旱、易存活、耐貧瘠、適應性強等優良特性，也是瘠薄旱地和鹽堿地重要的油料作物[2]。但由于馴化過程中的遺傳瓶頸，栽培向日葵缺乏必要的變異性以適應不斷變化的生物和非生物條件，如顏宏等[3]發現，各種鹽溶液浸種對向日葵種子萌發的影響依次是NaHCO3>混合鹽>NaCl。王桂芹等[4]從解剖學角度分析不同品種向日葵耐鹽性發現，低濃度的鹽處理能促進向日葵種子的萌發，并可以縮短種子的萌發周期。唐奇志等[5]利用海水處理向日葵幼苗，也發現低濃度鹽處理能促進向日葵的生長發育。孔東等[6]發現當土壤鹽分過高時，就會使植株生長發育緩慢，產量降低，甚至個別向日葵品種直接枯萎死亡。張俊蓮等[7]在生理方向進行研究，發現鹽脅迫對向日葵的所有細胞器傷害都非常大，表現為隨著鹽濃度的提高細胞器受到不同程度的損傷，且都呈現上升趨勢，導致其功能也隨著下降，甚至完全喪失。為了克服馴化種質中的這種缺陷，育種者利用野生物種來擴展遺傳變異性以摻入到優良的向日葵繁殖種群中，如劉海學等[8]在不同鹽濃度的MS培養基上分別誘導培養后得到了不同耐鹽程度的新向日葵株系，并已選育出幾種比較耐鹽的品種。銀葉向日葵(H.argophyllus)是栽培向日葵的最近親屬[1]。由于銀葉向日葵生長在干旱地區，有時也生長在海洋附近的土地上，因此有人認為它可能是耐鹽等位基因的良好來源[9]，也可用作向日葵改良中有利等位基因的供體[9]，并且它被認為是對非生物脅迫的耐受性來源[10]，目前國內外對向日葵耐鹽性的研究不多，因此研究銀葉向日葵耐鹽的形態和生理機制對于提高栽培向日葵耐鹽性具有重要意義。本研究以不同品種的向日葵幼苗為研究對象，采用250 mmol·L-1NaCl鹽溶液脅迫7 d的方法，進行了幼苗生長狀況的調查，通過分析比較銀葉向日葵與油葵自交系鹽脅迫前后的形態變化以及葉片中的葉綠素、脯氨酸、丙二醛含量及SOD活性等生理指標差異，來探究銀葉向日葵耐鹽的形態和生理基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

供試材料為銀葉向日葵ARG1807(Wt)，對照材料為陜葵2號的保持系(HA)和恢復系(HL)，所有材料均源于西北農林科技大學農學院旱區作物逆境生物學國家重點實驗室。

采用土培盆栽試驗，營養缽大小為7 cm×7 cm，每盆裝入200 g濕潤培養土。每盆精選籽粒飽滿均勻且無病蟲害的種子8粒，播后正常供應水分，幼苗生長至2葉1心時間苗，每盆定苗2株。4葉1心后開始進行250 mmol·L-1NaCl鹽脅迫處理。分別于鹽脅迫7 d后的上午10∶00，隨機選擇經過處理(NaCl)及未經處理(對照，CK)的植株葉片，用剪刀取下位于中部的葉片，將其分別放入取樣袋，然后放進有冰塊的保溫箱中，迅速帶回實驗室。在實驗室用液氮處理后將其放入-80℃冰箱保存，用于后續試驗指標的測定[11]，每個指標設置3個生物學重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態指標的測定 株高用直接測量法；葉面積用PC+相機法測定；生物量用烘干后稱重法測定[12]。

1.2.2 生理指標的測定 葉綠素含量(Chl/mg·g-1)測定采用乙醇比色法[13]；使用Li-6400便攜式光合測定儀(Li-Cor6400，USA)測定光合參數，包括：光合速率(Pn/μmol·m-2·s-1)、氣孔導度(Gs/mol·m-2·s-1)、胞間二氧化碳濃度(Ci/μl·L-1)以及氣孔限制值(Ls/%)[12]；采用茚三酮比色法測定脯氨酸含量(Pro/μg·g-1)[13]；丙二醛含量(MDA/μmol·L-1)的測定用硫代巴比妥酸法[13]。超氧化物歧化酶(SOD/U·g-1)活性用氮藍四唑法測定[13]；過氧化氫酶活性(CAT/ U·g-1·min-1)采用紫外吸收法測定[13]；過氧化物酶活性(POD/U·g-1·min-1)采用愈創木酚比色法測定[13]。離體葉片在暗處充分供水后，稱量鮮重，靜置于相同的環境條件下，每隔0.5 h進行稱重，計算各時間點的離體葉片失水速率[14]。以上指標的測定均重復3次，取平均值。

1.3 數據處理與分析

采用Microsoft Execl 2013和STSTSYS軟件進行實驗數據的處理與差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對向日葵幼苗生長的影響

由圖1可知，與正常供水相比，鹽脅迫處理下參試品種向日葵的株高、葉面積(7 d)以及根、莖、葉生物量(7 d)均有所降低。 HA、HL以及Wt的株高增量分別比對照減少了58.22%、40.32%和24.53%；葉面積增量分別比對照減少了54.31%、46.70%和38.21%。比較不同品種下降幅度可以看出，Wt的株高、葉面積增量降幅最小，HA降幅最大。 HA、HL的株高增量、葉面積增量與CK相比差異顯著(P<0.05)，Wt的株高增量、葉面積增量與CK差異不顯著(P>0.05)，反映出鹽脅迫對Wt株高、葉面積的影響較小。生物量的研究表明，鹽逆境下各品種向日葵的根、莖及葉生物量均小于CK且差異不顯著(P>0.05)。

注：CK—對照；NaCl—250 mmol·L-1NaCl處理；**表示CK與NaCl處理在0.01水平上差異顯著，*表示CK與NaCl處理在0.05水平上差異顯著。下同。 Notes: CK—control; NaCl—salt treatment. ** indicates that CK and NaCl treatment differ significantly at P<0.01 level. * indicates significant difference at P<0.05 level between CK and NaCl treatment. The same below.圖1 鹽脅迫7 d向日葵的生長特性Fig.1 Growth characteristics of sunflower under salt stress for 7 days

2.2 鹽脅迫對向日葵光合生理特性的影響

在250 mmol·L-1NaCl處理后，各品種葉綠素含量呈現出明顯的下降趨勢(圖2A)，HA、HL、Wt的葉綠素含量分別比對照下降了 28.34%、40.59%、3.81%，HL的變化幅度最大。經過差異顯著性分析，鹽處理下的HA、HL與CK間的差異達到顯著水平(P<0.05)，Wt的差異未達到顯著水平，反映了鹽脅迫對Wt的影響小。從圖2B、C中可以看出鹽逆境下Pn和Gs值呈極顯著(P<0.01)下降。從圖2D、E中可以看出各向日葵品種在鹽脅迫后Ci值極顯著(P<0.01)低于對照，導致氣孔限制值Ls顯著上升。這充分說明了鹽逆境與向日葵的光合速率有很大關系，它可能會導致向日葵氣孔關閉，也可能會直接破壞其光合系統，使向日葵的光合速率顯著下降。

圖2 鹽脅迫7 d向日葵的光合參數Fig.2 Photosynthetic parameters of sunflower under salt stress for 7 days

2.3 鹽脅迫對向日葵耐鹽生理指標的影響

2.3.1 脯氨酸含量 鹽逆境下，植株通過積累滲透物質，降低滲透勢，保證細胞可以繼續從外界吸水[15]。在鹽脅迫7 d時，各參試品種與CK脯氨酸含量差異均達極顯著水平(P<0.01)，見圖3。HA、HL、Wt的脯氨酸含量分別比對照增加了 176.10%、277.87%、279.94%。各品種增加幅度為Wt>HL>HA，說明Wt在鹽脅迫下能夠積累更多的脯氨酸，來增強其滲透調節能力，緩解逆境壓力，抗鹽能力較強。

2.3.2 丙二醛及保護酶活性 從圖4可以看出，正常條件下3個品種的MDA含量處于較低水平，在250 mmol·L-1NaCL處理下，3個品種MDA含量分別比對照增加了352.62%、85.22%、231.10%。

比較鹽脅迫下不同品種SOD、POD及CAT的增幅，可發現鹽逆境下，Wt葉片的SOD增幅為65.09%，POD活性的增幅為211.11%，CAT活性的增幅為55.91%，鹽脅迫下Wt的SOD、POD及CAT增幅均高于其他兩個品種，表明Wt清除活性氧的能力較好，耐鹽性較強。

2.3.3 葉片表型及失水速率 為進一步探究3個向日葵品種在非氣孔因素方面的差異，對向日葵葉片表型進行觀察發現：Wt的葉片表皮毛長度及密度遠遠多于HA和HL，且其下表皮表皮毛數目顯著多于上表皮，而HA及HL上表皮表皮毛的長度及密度均多于下表皮(圖5)。

圖3 鹽脅迫7 d向日葵的脯氨酸含量Fig.3 Proline content of sunflower under salt stress for 7 days

圖4 鹽脅迫7 d向日葵的MDA含量以及SOD、POD、CAT酶活性Fig.4 Contents of MDA and the activity of SOD,POD and CAT in sunflower under salt stress for 7 days

注：圖(a)、(c)、(e )分別為HA、HL、Wt的上表皮；圖(b)、(d)、(f)分別為HA、HL、Wt的下表皮。 Note: figues (a),(c) and (e) are the upper epidermis of HA, HL and Wt, respectively; figues (b), (d) and (f) are the lower epidermis of HA, HL and Wt， respectively.圖5 向日葵葉表面掃描電鏡圖(30×)Fig.5 Scanning image at electron microscope of sunflower leaf surface

圖6 向日葵葉片失水速率Fig.6 Water loss rate of sunflower leaf

由圖6可見，隨著時間的變化，3個向日葵品種葉片失水速率均顯著上升。HA的葉片失水速率一直高于其他兩個品種；在30 min之后，可以明顯看出Wt的葉片失水速率一直低于HA、HL,在失水時間為150 min時，HA的失水速率最高，達84%；Wt的葉片失水最慢，失水速率為69%，說明Wt在葉片保水方面具有顯著優勢，可能是由于其葉片表面密生表皮毛。

3 討論與結論

當植物遭受鹽脅迫時，會出現一系列的可見表現，如生長速率減慢，葉色變淡乃至葉片脫落，甚至是植株死亡等；同時生理指標也會發生改變，如丙二醛和脯氨酸含量增加[16-18]，光合速率減慢[16,19]，膜透性增大[18]等。不同植物因其組織結構和生理功能不同，耐鹽能力也有所差異。本試驗發現，250 mmol·L-1的高濃度NaCl脅迫會對向日葵的生長造成傷害，HA、HL的株高、葉面積及生物量均顯著下降(P<0.05)，表明鹽脅迫對它們的生長造成了損傷且對其生物學產量的積累產生了抑制作用。而Wt表現為株高和葉面積與對照相比無明顯差異(P>0.05)。王新偉等[20-21]發現鹽脅迫阻礙馬鈴薯的生長與發育，使其出苗率降低、產量下降。丁順華等[22]認為鹽脅迫會影響小麥出苗時間和出苗率。Munns[23]等經過研究發現，植株若長期處在鹽逆境中，會導致其葉面積縮小。本研究與上述研究結果基本一致。

在鹽脅迫條件下，衡量植物耐鹽性的生理指標之一是葉片光合色素含量。葉綠素是植物進行光合作用的最主要色素，葉綠素含量的變化在一定程度上能反映植物進行光合作用的強度[12]。本試驗表明，經鹽脅迫處理后，葉綠素含量下降幅度：HL>HA>Wt，說明Wt相較于HA、HL來說，所受鹽逆境影響較小。植物與環境CO2和水汽的交換通過改變氣孔開度等方式進行[12]，從而調節光合速率與蒸騰速率來適應逆境環境。葉片光合速率降低一般為氣孔和非氣孔兩個原因，主要依據Ci和Ls的變化方向來進行判定，當Ci降低、Ls升高時，主要是由于氣孔因素；Ci升高而Ls下降則非氣孔是主要因素[24-25]。本試驗發現在鹽脅迫處理后參試向日葵的Ci均顯著下降，而Ls顯著上升，說明向日葵光合速率顯著降低主要是由于氣孔因素，其中氣孔導度降低，CO2供應不足，限制了光合的順利進行。

有研究表明，番茄表皮毛的不同密度和類型與其抗逆效果的關系非常緊密，表皮毛豐富的番茄可能具有抗冷的特性，經過相同的脅迫處理發現，很多表面帶有致密絨毛的野生番茄在冷害下比其他不具備致密腺毛特征的普通番茄的生存率更高[36]。相關文獻表明，在植物受到來自外界的脅迫如冷害、干旱以及病蟲危害時，表皮毛會通過自身的免疫反應產生某些防御化合物，從而保護植物不受侵害[37]。本研究中Wt的光合速率降低，主要是氣孔因素，與栽培向日葵并無差異，而Wt葉片表面密生表皮毛，與栽培向日葵相比，在降低葉片失水速率方面具有顯著優勢，說明Wt失水速率慢與非氣孔因素相關，有待于進一步研究。