低氮對苦蕎苗期土壤碳轉化酶活性的影響

陳 偉，楊 洋，崔亞茹，孫從建，張永清,2

(1.山西師范大學地理科學學院，山西 臨汾 041000；2山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾 041000)

關鍵字：苦蕎；低氮；苗期；土壤；β-葡糖苷酶；蔗糖酶；纖維素酶

碳是構成植物和微生物生命體最重要的基礎元素，在根際系統中所占比重最大，轉化過程也比較復雜[1]，很大程度上決定著根際系統運轉的方向與強度。施用氮肥對土壤碳素轉化積累有一定影響，能促進土壤有機碳庫的積累[2]。王慧等[3]研究證明，合理施用氮肥可以有效促進黃土高原旱地0～20 cm土層土壤有機碳、有機氮積累，提高土壤氮素礦化能力，降低氮素礦化速率，可以有效提高旱地土壤有機氮、有機碳含量和土壤供氮能力。楊瑒等[4]認為施入適量的氮肥可以改善寒區鹽堿地的土壤理化性質，促進土壤微生物的生長，從而改善土壤質量。夏雪等[5]的研究證明氮肥的施用可以提高土壤微生物群落碳源利用率、微生物群落的豐富度和功能多樣性。而碳素的存在是促進土壤氮素轉化的相關因素[6]。碳素對土壤氮素的轉化速率也有一定影響[7]，研究表明，葡萄糖的添加使土壤微生物對無機氮素固持作用顯著增強，無機氮向有機氮的轉化速率也相應提高[6]。土壤酶參與了土壤環境中的生物化學過程，是土壤中的生物催化劑[8]，也是土壤有機體的代謝動力，與有機物質分解、能量轉移等密切相關[9-10]，其活性比較敏感，一定程度上反映土壤的狀況[11]。土壤酶活性與土壤肥力的關系十分密切[12]。安婷婷等[13]研究表明，小麥根際土壤特性可以通過改善土壤酶活性，從而促進土壤氮素的順利轉化和供應，提高根系生長和植株養分的吸收。土壤β-葡糖苷酶、土壤蔗糖酶與土壤纖維素酶均可表征土壤碳轉化循環速率，可作為指標表征其影響。目前，關于低氮脅迫對作物的影響已有較多研究，但大多數研究集中在作物的生理響應、作物適應性、產量等地上部分，對于作物的不同品種在低氮脅迫下響應機制研究較少。

植物在逆境條件下能夠感應外界脅迫,并通過自身調節系統使之在生理和形態上發生應激反應,以增強在脅迫條件下的生存機會,而且不同作物及同一作物不同品種對逆境的適應性有很大的差異[14-16]。植物根系通過吸收和分泌作用改變了根際土壤的環境條件，進而影響植物養分的有效性及其吸收轉化[17]。有研究表明植物在逆境環境下根系向土壤中的分泌物發生改變，且不同耐性的品種表現出不同的碳源選擇偏好，如耐瘠性的品種更傾向于利用結構簡單的碳源，而敏感品種更傾向于利用結構相對復雜的碳源[18]。有研究表明種子成熟期80%的氮素供給來自開花前植物體內養分的積累及后期在體內的轉移[19]，玉米花前營養器官氮素轉運對籽粒氮素累積貢獻率為42%～62%[20]，所以作物開花前即苗期的土壤養分供給研究尤為重要。李敏等[21]研究表明，與低產作物品種相比，高產作物品種具有苗期氮素積累快的特點。隋鵬祥等[22]的研究表明，施氮能顯著提高花前氮素轉運率和轉運量，且隨著施氮量的增多氮素積累逐漸增大，但施氮量超過一定量后，氮素積累差異不顯著。Chen等[23]研究表明，逆境脅迫下土壤養分循環中酶起到的調節作用顯著大于微生物。苦蕎是自然界中甚少的藥食兩用作物，苦蕎不僅擁有很高的營養價值、藥用價值及保健功能[24]，對于一些逆境環境也有一定的自我調節功能，不同苦蕎品種對于養分的利用以及在逆境下的響應機制是否有所差異？是否也存在碳源選擇偏好？本研究擬通過兩種不同耐氮性苦蕎品種，設計不同施氮量的盆栽試驗，對苦蕎苗期土壤碳轉化酶(單糖酶：β-葡糖苷酶；二糖酶 ：蔗糖酶；多糖酶：纖維素酶)活性進行分析研究，以期為苦蕎的優質高效生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤為黃土母質上發育而成的褐土，土壤pH值為7.75，土壤有機質為2.07 g·kg-1，有機碳含量為1.2 g·kg-1，銨態氮含量為0.39 mg·kg-1，硝態氮含量為0.23 mg·kg-1。供試作物為耐氮能力強的迪慶苦蕎(DQ)和耐氮能力弱的黑豐1號(HF)[25]，迪慶苦蕎由迪慶藏族自治州農業科學研究所提供，黑豐1號由山西省農業科學院高寒作物研究所提供。兩個品種生育期無明顯差異，均為105 d左右。

1.2 試驗設計

試驗于2017年5-8月在山西師范大學塑料大棚里進行。采用盆栽試驗，營養缽大小為35 cm×35 cm，每盆均裝入10 kg黃土。試驗采取二因素完全隨機設計，因素A為不同耐氮性苦蕎品種：迪慶苦蕎和黑豐1號；因素B為不同氮素處理水平：對照(CK，不施氮肥)、低氮處理(N1，0.8 g·10kg-1)和正常供氮(N2，1.6 g·10kg-1)。共有6種處理組合，每個處理均重復4次。氮肥為尿素(含氮量46.4%)，其中磷肥(P2O5,150 mg·kg-1)和鉀肥(K2O,60 mg·kg-1)均作為底肥施用，將肥料與黃土充分混勻，所有肥料均為一次性施入。每盆精選16粒飽滿均勻無病蟲害的苦蕎種子，經過蒸餾水沖洗干凈后放置在裝有清水的燒杯中，浸泡24 h后于2017年5月8日均勻播種后正常澆水，所有盆栽每日等量澆入400 mL水以保證正常生長。為盡可能減少氣候對試驗的影響，試驗期間如遇雨天加蓋塑料薄膜以防雨，氣溫超過30℃時會在中午加蓋遮陽網以避免溫度過高對試驗的影響。

苦蕎苗期(2017年6月3日)從各處理隨機挑選3株，靠近苦蕎根際小心將苦蕎整株采出，并收集深度為0～10 cm的土壤。土壤樣品一部分除雜質后過1 mm尼龍篩，4℃冰箱內保存，用來測定土壤氨態氮、硝態氮以及酶活性；另一部分風干后除雜質過篩，用來測定土壤pH值、有機碳等理化指標。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 苦蕎形態指標 用直尺測定株高；莖粗用游標卡尺測定；葉面積采用Li-3000便攜式葉面積儀測定。

1.3.3 蔗糖酶 以8%蔗糖溶液為底物，土樣在37℃下培養24 h后離心，取1 mL上清液后加入3 mL DNS試劑,沸水浴加熱5 min，顯色，冷水浴中冷卻至室溫并定容至50 mL，在508 nm的條件下比色測定還原糖[12]。

1.3.4 纖維素酶 以1%羧甲基纖維素溶液為底物，將土樣在37℃下培養72 h后離心，取1 mL上清液后加入3 mL DNS試劑,沸水浴加熱10 min顯色，冷水浴中冷卻至室溫并定容至25 mL，在540 nm的條件下比色測定還原糖[12]。

1.3.5β-葡糖苷酶 用緩沖的對硝基苯-β-D葡糖苷為底物，土樣在37℃下培養1 h，生成的對硝基酚與堿性THAM緩沖液顯色，用比色法測定。

1.4 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2007進行處理；使用SPSS 18.0軟件進行裂區分析，采用單因素(ANOVA)方差分析，用Duncan’s對不同處理間進行多重比較來判斷差異顯著性(P<0.05)，采用CANOCO 4.5軟件進行主成分分析；用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 低氮處理對不同耐氮性苦蕎苗期形態指標的影響

由表1可知，不同氮處理對HF的株高有一定影響，N1和N2處理的株高與CK處理的株高存在顯著差異(P<0.05)，N1和N2處理分別比CK處理高30.2%和32.8%。同一氮處理下的兩種苦蕎之間株高無顯著差異。HF的莖粗在N2與CK處理之間存在顯著差異(P<0.05)，CK處理下莖粗最小，為2.84 mm，N2處理下的莖粗最大，CK較N2低17.2%；在CK和N1處理下DQ莖粗顯著高于HF，兩種處理分別比HF高了23.6%和25.3%。N1和N2兩種處理下，兩種苦蕎的葉面積顯著高于CK，HF分別比CK高84.2%和84.9%,DQ則分別比CK高119%和136%。HF與DQ均表現為隨施氮水平的提高株高、莖粗和葉面積逐漸增大，且同一氮處理下HF的各項形態指標均小于DQ。綜上可見，氮肥的添加可以有效促進苦蕎株高、莖粗和葉面積的生長，耐氮性強的苦蕎表現出品種優勢，在低氮脅迫下具有更強的耐性，長勢更好。

2.2 低氮處理對不同耐氮性苦蕎苗期土壤理化性質的影響

2.3 低氮處理對不同耐氮性苦蕎苗期土壤酶活性的影響

氮處理、品種及其交互作用均對苦蕎土壤β-葡糖苷酶和蔗糖酶產生極顯著影響，品種及其與氮處理的交互作用對纖維素酶也產生了極顯著的影響(P<0.01)(表2)。由圖1(a)可以看出，同一氮處理下兩種苦蕎的土壤β-葡糖苷酶活性均存在顯著差異(P<0.05)，在CK和N1處理下均表現為DQ>HF，而在N2處理下則表現為HF>DQ，且HF在N2處理下表現為酶活性最高。CK和N1處理下DQ較HF分別增加了11.6%和58.3%，N2處理下DQ比HF低了19.7%。HF的N2處理顯著高于其余兩種氮處理，分別比CK和N1高了92.1%和94.2%；DQ施氮肥的處理(N1和N2)顯著高于CK，分別高了40.2%和38.2%。可見，施氮肥可以顯著提高苦蕎的土壤β-葡糖苷酶活性。由圖1(b)可知，兩種苦蕎之間的土壤蔗糖酶均存在顯著差異，HF 3種氮處理下的土壤蔗糖酶活性之間均存在顯著差異，DQ的N1處

表1 不同氮處理下苦蕎苗期形態及土壤理化指標

注：表中數據為平均值±標準差。不同大寫字母表示同一氮處理不同品種在P<0.05水平差異顯著，不同小寫字母表示同一品種不同氮處理在P<0.05水平差異顯著。CK—不施氮肥，N1—低氮處理，N2—正常供氮處理，下同。

Notes: Data in the
Table are mean ± standard deviation. The different uppercase letters represent different varieties significantly different in the probability level ofP<0.05 under the same treatments; different lowercase letters indicate that the different treatments have significant differences in the probability level ofP<0.05 with same variety. CK—no nitrogen fertilizer, N1—low nitrogen treatment, N2—normal nitrogen treatment, the same below.

表2 苦蕎苗期不同品種及氮處理土壤理化指標裂區分析

注：*表示有顯著影響，**表示有極顯著影響，ns表示影響不顯著。

Notes:“*” indicates significant effects (P<0.05). “**” indicates very significant effects (P<0.01). “ns” is not significant effects.

注 Note：HF—黑豐1號 Heifeng No.1；DQ—迪慶苦蕎 Diqingkuqiao. 下同。The same below.圖1 不同氮處理下不同苦蕎品種苗期根際土壤碳轉化酶活性Fig.1 Three carbon invertase activities in rhizosphere soils of different varieties of tartary buckwheat during the seedling stage under different N treatments

理顯著高于其余兩種氮處理(P<0.05)。N1處理下DQ為HF的3.3倍，其余兩種氮處理下均表現為DQHF，3種氮處理下DQ較HF分別增加了66%、40%和22%。隨著土壤中施氮量的增加，HF的土壤纖維素酶活性表現出逐漸增加的趨勢，而DQ則為逐漸遞減。HF施氮肥(N1和N2)的處理均顯著高于對照，分別比CK高了56.6%和72.9%。DQ的N2顯著低于CK 29.2%。綜上可知，在低氮脅迫下耐氮性強的苦蕎由于品種優勢，根系會分泌更多的碳轉化酶，為苦蕎生長提供更多的碳源。

2.4 低氮對不同苦蕎品種苗期土壤碳轉化酶活性及理化性質影響的主成分分析

注 Note：Suc—蔗糖酶 sucrase；Cel—纖維素酶 cellulase；Glu：β-葡糖苷酶 β-glucosidase；SM—土壤含水量 soil moisture content；pH—土壤pH值 soil pH；SOC—土壤有機碳 soil organic 銨態氮 soil 硝態氮 soil 圖2 不同氮處理下2個苦蕎品種苗期土壤酶 及理化性質的主成分分析Fig.2 Principal components analysis (PCA) of soil enzymes and physicochemical properties of tartary buckwheat seedlings under different nitrogen treatments

3 討 論

在農業生態系統中，碳循環是作物養分有效性中的重要一環，土壤中的碳供應缺失可能會影響到其它養分的有效性，進而可能會導致農產品產量與品質的下降[27]。土壤酶在土壤生態系統中很活躍，在營養物質轉化與有機質分解等方面起著很重要的作用[19]，其活性反映了土壤中各種生物化學過程的強度和方向，是土壤質量和生態系統健康的重要指標。施肥可以通過改善土壤養分狀況以及促進作物發育而影響土壤酶活性。適量施用N、P、K等無機肥料和長期有機與無機肥配施都能顯著提高土壤酶活性[28]，進而提高農田生態系統的生產力。

3.1 低氮脅迫下苦蕎苗期形態特征

本研究中，同一氮處理下耐低氮苦蕎品種的株高、莖粗、葉面積均大于不耐低氮苦蕎品種，可能是在低氮脅迫下，苦蕎會通過自身的一些生理生化調節以更好地適應低氮環境。株高、莖粗、葉面積反映苦蕎的生長狀況，同一品種的苦蕎株高、莖粗、葉面積均隨著施氮水平的提高而逐漸增大。張楚等[29]研究表明，低氮脅迫下苦蕎幼苗葉片面積顯著下降，耐低氮苦蕎品種在低氮環境中具有更好的地上部生長形態，受低氮影響較小，適應性更強。白文琴[30]研究表明隨著氮肥用量的增多苦蕎株高呈現出增加的趨勢，同時充足的氮素會促進苦蕎細胞的分裂與增長，進而促進苦蕎葉面積的增大，與本研究結果基本一致。

3.2 低氮脅迫下苦蕎苗期土壤理化性質特征

3.3 低氮脅迫下苦蕎苗期不同品種碳源選擇偏好

β-葡糖苷酶是單糖酶，它能降解真菌細胞壁作為氮源和碳源，也是纖維素降解過程中參加限速步驟的酶；蔗糖酶為二糖酶，可以利用低分子量底物，蔗糖酶活性的高低也可以表征土壤中碳循環速度[37]；纖維素酶為多糖酶，可以分解土壤中的纖維素。土壤中碳酶分解生成的葡萄糖作為土壤微生物的可用能量和碳源，可以引發土壤微生物活動和生長，增加了無機氮的固定，并且具有較低的氮礦化速率，可以促進植物體對氮素的吸收利用[38]。

本文研究結果顯示，迪慶苦蕎在低氮脅迫下可以利用更多結構簡單的碳源，而在常氮處理下，不耐低氮的黑豐1號顯示出品種的差異，利用更多碳源。孫波等[17]研究表明，根際環境中氮素匱乏通常會刺激到植物根系的生長從而增加吸收面積，提高養分的空間有效性。張楚等[29]研究表明，在低氮脅迫下耐低氮苦蕎品種的主根長、根系平均直徑、根系體積、根系表面積、根系干重等均高于不耐氮品種，低氮環境在一定程度上可以促進耐氮品種根系生長，不耐低氮品種受低氮脅迫的影響更大。大量的根系在土壤中穿插使根尖破損會釋放出更多的胞外酶，低氮脅迫下，耐低氮苦蕎品種可能通過單糖酶數量的增加來調節土壤中的碳氮比值，增加微生物等代謝的活性，增加土壤中氮素的釋放，提高對養分的利用，滿足自身的生長需求。有研究表明，耐受性小麥品種對碳源利用率的增加是由于土壤微生物代謝活性的提高，有利于提高碳利用效率并降低呼吸損失[18]。較少的根系生物量會降低土壤中的纖維二糖水解酶活性和乙酰葡糖胺-氨基己糖苷酶活性[39]。有研究表明，低氮脅迫下，耐低氮苦蕎根系活力和硝酸還原酶活性高于不耐低氮苦蕎[29]。呂鳳蓮等[40]通過研究發現低水平的氮添加對油松幼苗土壤蔗糖酶和脲酶活性均有促進作用，這與本研究結果基本一致。

低氮脅迫下，多糖酶(纖維素酶)活性在品種間的趨勢和單糖、二糖酶相同，均為迪慶苦蕎大于黑豐1號，但是常氮處理下，與單糖和二糖酶相比較，迪慶土壤中的纖維素酶活性依然顯著高于黑豐1號，結果表明耐低氮能力強的迪慶苦蕎偏好于結構較復雜的碳源，而耐低氮能力弱的黑豐1號則更偏向利用碳源結構較為簡單的化合物。孫鋒等[41]發現在棕黃砂質土壤中纖維素酶活性的強弱與土壤中氮素供給有很好的相關性。Bao等[18]的研究結果表明，土壤微生物并非平等利用所有可用的碳源，不同耐受性的作物品種擁有不同的碳源選擇偏好。有研究表明[5]不同施氮水平土壤微生物功能多樣性差異明顯，起分異作用的主要碳源是糖類和氨基酸類。土壤微生物的活性可能會因逆境脅迫對作物根系分泌物的影響而發生改變，這為微生物分解提供了基質[39]。在氮素豐富的土壤中，土壤微生物吸收作為低分子量微生物溶解有機氮的氨基酸為它們提供碳以刺激呼吸，進而滿足其的氮需求[33]。由于土壤微生物可以通過改變營養物質的可利用性和資源分布來間接影響植物生產力，土壤酶活性的這些變化也可能反映了苦蕎品種對低氮脅迫的敏感性，并反過來影響植物的生長。

4 結 論

氮肥處理和品種均對苦蕎土壤碳轉化相關酶活性產生顯著的影響。低氮脅迫下，迪慶苦蕎土壤中單糖、二糖、多糖酶的活性均高于黑豐1號，但是在常氮處理下，黑豐1號的單糖、二糖水解酶顯著高于迪慶苦蕎，而多糖水解酶的活性卻顯著低于迪慶苦蕎。不同耐氮性的苦蕎品種對碳源的選擇偏好不同，耐氮能力強的苦蕎品種更偏向于利用較為復雜的碳源，在低氮脅迫的環境下則偏向于利用結構簡單的碳源，而耐氮能力弱的苦蕎品種更偏向于利用簡單的碳源，但多集中在正常施氮的環境下，低氮脅迫下對碳源利用較少。

致謝:非常感謝迪慶藏族自治州農業科學研究所與山西省農業科學院高寒作物研究所對本課題提供的品種。