拮抗尖孢鐮刀菌的藍莓菌根真菌的篩選和鑒定

張 雁 袁 泉 劉莉莉 方明明 徐德聰

（合肥師范學院 生命科學學院，安徽 合肥 230601）

藍莓是杜鵑花科越橘屬植物，果實富含營養，是我國新興的種植項目[1]，在我省宣城、懷寧和合肥等地大量種植。藍莓在栽培中由真菌引起的病害達20多種[2-3]，最常見的藍莓根腐病是藍莓產量下降的主要原因[4]。尖孢鐮刀菌可以導致多種植物病害[5]，侵染藍莓根系時會導致藍莓根腐病[6]。尖孢鐮刀菌從植物根部入侵后，可損害植物的維管束，導致植物根冠腐爛[7-9]及減產或絕產[10]。藍莓根腐病的傳統治療方法為大量使用農藥，不但成本高昂，還會造成嚴重的環境污染，并導致藍莓的經濟價值下降。而生物防治溫和、安全、持久，可有效的避免化學防治的弊端。

菌根真菌可以提高植物的防御能力[11-12]，減少相關疾病的發生[13]。藍莓的根系可以和內生的真菌共生，形成菌根結構[14]，這些菌根真菌的菌絲在土壤中可以形成網狀結構，可有效的擴大植株根系利用的土壤范圍，進而促進藍莓生長[15]。藍莓根部的細胞和組織能夠被菌根真菌的菌絲體侵染[16]，最終可以增強藍莓的適應性和抗病性，提升藍莓的產量[17]。因此，本研究從宣城、懷寧和合肥等地的藍莓根系中分離并鑒定出多種菌根真菌，并從中篩選出多株可以有效拮抗尖孢鐮刀菌的藍莓菌根真菌，對藍莓根腐病的生物防治中具有重要的應用價值和應用潛力。其中篩選出的拮抗尖孢鐮刀菌的棘孢木霉Hfsu02的拮抗能力最強，且可以有效侵染藍莓根系，具有防治藍莓根腐病等由尖孢鐮刀菌引起的植物病害的應用價值。

1 材料和方法

1.1 培養基與試劑

DNA凝膠回收試劑盒（上海生工），真菌基因組提取試劑盒（上海生工），Taq DNA聚合酶（上海生工），其他化學試劑均為國產分析純。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，加適量（約500 mL）的去離子水煮熟，搗碎攪拌，用兩層紗布進行過濾，取濾液加入葡萄糖20 g，充分混勻并定容至1000 mL。

基礎培養基（馬丁氏改良）：NH4NO35 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，葡萄糖 10 g，微量元素混合液0.1 mL，定容至1000 mL。

培養基滅菌條件為121℃，20 min或115℃，20 min（含糖培養基）。

1.2 藍莓根系樣品采集

2018年4月從安徽宣城、合肥和懷寧地區藍莓種植園中采集生長年限均為5～6年的藍莓（奧尼爾品種）的藍莓根樣各5個樣品。用滅菌采樣袋分裝好，24 h內分離菌根真菌。

1.3 菌根侵染率研究

菌根侵染使用優化后的臺盼藍染色法[18]進行測定：無菌條件下，將根段切成1 cm長的根段，無菌水沖洗干凈，放入FAA固定液（38%甲醛5 mL＋乙酸5 mL＋50%酒精90 mL＋甘油5 mL）固定15 min，取出后放在10%KOH/NaOH溶液95℃水浴1 h后用無菌蒸餾水沖洗至無色后染色（染液配方：臺盼藍 0.05 g＋苯酚 20 g＋乳酸 20 mL＋甘油 40 mL＋蒸餾水20 mL）12 h后用丙三醇（乳酸）中脫色30 min，通過光學顯微鏡觀察，計算侵染率，公式如下：

1.4 藍莓根系共生菌根真菌分離純化

將根段剪成1 cm長，用無菌水沖洗干凈后采用表1的消毒方法對菌根表面的微生物進行消毒處理。因為不同的菌根真菌對不同的消毒劑的耐受性不同，本研究同時使用兩種消毒方法。通過預實驗優化，這兩種方法均能有效抑制根系表面雜菌。方法一和方法二各采用不同的消毒劑進行兩步消毒。每次消毒之后使用無菌水清洗。

表1 藍莓菌根消毒方法

將不同消毒方法消毒過后的根段，放在PDA平板中30℃培養（一個平板上放置8～10段根段），篩選出不同的菌根真菌。挑取根段內部長出的菌絲體到PDA液體培養基中,在30℃恒溫搖床中200 r/min振蕩培養，菌液稀釋至10-5并用移液槍吸取0.2 mL涂布于PDA平板中，30℃培養至孢子生成，使用孢子濾器分離孢子，稀釋后涂布于PDA平板中，重復以上操作，直至獲得純化的單克隆。

1.5 菌根真菌的分子鑒定

使用真菌基因組提取試劑盒 （上海生工）進行總DNA提取，使用通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增ITS的部分序列。引物序列為ITS1，5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′；ITS4，5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′。PCR 擴增條件：94℃預變性 5 min，循環條件是 94℃變性 30 s，55℃復性30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環，最終72℃延伸10 min。擴增后的ITS序列使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送生工生物工程（上海）有限公司測序。在NCBI中進行Blast比對，并使用軟件MEGA7.0構建系統進化樹，確定分離菌株的種屬和分類地位。

1.6 拮抗尖孢鐮刀菌的菌根真菌的篩選

利用濾紙片擴散法測抑菌效果：取尖孢鐮刀菌懸液0.1 mL均勻涂布在PDA培養基中，貼敷上浸過不同菌根真菌（除尖孢鐮刀菌外）液體培養懸液10 min的直徑為6 mm的濾紙片，用無菌水試片作為空白對照。30℃恒溫培養72 h，用十字交叉法測抑菌圈直徑。通過初篩篩選出的菌株，采用濾紙片擴散法進一步復篩，重復3次，統計分析結果。

1.7 拮抗尖孢鐮刀菌的菌根真菌Hfsu02的形態特征鑒定

吸取100 μL菌根真菌Hfsu02菌液接種于PDA固體培養基上，涂抹均勻。逐日觀察菌根真菌Hfsu02的菌落形態特征。取孢子懸液0.1 mL接種在PDA液體培養基中，30℃條件下200 r/min振蕩培養48 h，觀察形成的菌球的形態特征。

1.8 Hfsu02在基礎培養基上的培養特性研究

基礎培養基相比較于PDA培養基，成份更加穩定，更適合研究Hfsu02的培養特性。在30 mL液體基礎培養基中加入200 μL菌根真菌Hfsu02的孢子懸液，200 r/min的振蕩培養48 h，通過稱干重法對菌根真菌Hfsu02的最適溫度、pH進行測定，然后在最適溫度和最適pH條件下測定Hfsu02在基礎培養基中的生長曲線。

最適pH的測定：設置的pH梯度為 3、4、5、6、7，每組設置三個平行。溫度選用真菌常規培養溫度30℃，200 r/min振蕩培養48 h，測量培養后菌絲體的干重，統計分析菌根真菌Hfsu02的最適pH。

最適溫度的測定：設置的溫度梯度為20℃、25℃、30℃和35℃，每個溫度設置三個平行，培養基pH調為最適，200 r/min振蕩培養48 h，測量培養后菌絲體的干重，統計分析菌根真菌Hfsu02的最適生長溫度。

生長曲線測定：在最適pH，最適溫度下，200 r/min振蕩培養，定時稱量30 mL培養基中的菌絲干重，構建棘孢木霉Hfsu02在基礎培養基中的生長曲線。

2 結果和分析

2.1 安徽不同地區藍莓（奧尼爾品種）侵染率與侵染形態觀察

將安徽不同藍莓栽培土壤中的5～6年生奧尼爾品種的根段經臺盼藍染液染色后，置于顯微鏡下觀察，發現不同土壤中的藍莓根系均有侵染現象（圖 1）。

圖1 安徽不同地區藍莓根系菌根侵染顯微圖（10×40）

其中圖1-A、圖1-B、圖1-C為宣城地區紅壤栽培藍莓根系侵染形態，其菌根真菌既有根外菌絲（圖1-A、圖1-B），又有胞間貫穿菌絲和胞內菌絲團（圖 1-C）；圖1-D、圖1-E、圖 1-F為合肥地區改良水稻土栽培藍莓根系侵染形態，侵染的菌根真菌多為外生菌絲（圖 1-D、圖 1-E、圖1-F）；圖1-G、圖1-H、圖1-I為懷寧地區紅黃壤栽培藍莓根系侵染形態，侵染的菌根真菌即有外生菌絲（圖1-G、圖1-H）又有胞內菌絲團和胞間貫穿菌絲（圖 1-I）。

根據觀察結果，統計安徽省各地區不同土壤栽培的藍莓根系菌根真菌侵染率（表2）。

表2 安徽不同地區藍莓菌根真菌侵染率（%）

2.2 菌根真菌的分離與菌落特征

在安徽宣城地區中紅壤栽培的藍莓根系中純化出7種形態不同的菌根真菌，在合肥地區改良水稻土栽培的藍莓根系中純化出6種菌根真菌，懷寧地區紅黃壤中純化出4種菌根真菌，經鑒定后排除污染菌株，統計菌株及其在PDA培養基上的菌落形態特征（表3）。

表3 安徽不同藍莓栽培土壤中藍莓根系真菌菌株形態特征

2.3 菌根真菌分子鑒定

PCR擴增結果顯示，篩選出的菌根真菌的ITS序列擴增條帶較為清晰，條帶長度在500～750 bp，符合預期（圖2）。條帶純化后，送上海生工測序。

圖2 17種藍莓菌根真菌ITS序列PCR產物電泳圖

將測序結果在NCBI數據庫進行Blast序列比對，根據比對的結果，選取真菌中和測序鑒定結果相關主要的種屬，獲取代表種的ITS序列，以Colletotrichumcoccodes和Saccharomyces cerevisiae作為外類群，共47個ITS序列使用鄰接法構建系統進化樹（圖3）。

圖3 安徽不同地區藍莓菌根真菌系統進化樹（NJ法）

分析地位。經鑒定，從根系分離出的真菌共分屬六個屬，其中 Xcsu02、Xcsu03、Xcsu04、Hfsu02和Hfsu03和相關菌種聚為E組，為木霉屬（Trichoderma），是分離株數最多的優勢菌屬；Xcsu05、Xcsu06、Hfsu05、Hnsu01 和相關菌種聚為D組，分屬于鐮刀菌屬（Fusarium）顯示三地藍莓均存在不同程度的根腐病感染；Xcsu07、Hnsu04、Hnsu06、Hnsu03和相關菌種聚為B組，分屬于曲霉屬（Aspergillus）；Hfsu01、Hnsu02 和相關菌種聚為 A組，分屬于青霉屬（Penicillium）；Hfsu04和相關菌種聚為C組，分屬于枝孢屬（Cladosporium）；Xcsu08和相關菌種聚為F組，分屬于Rhizopus（根霉屬）。具體比對鑒定結果見表4。

表4 安徽不同地區藍莓根系菌根真菌分子鑒定結果

在安徽宣城紅壤篩選出的7株菌株中，有3株為木霉屬，2株為鐮刀菌屬，1株為曲霉屬，1株為根霉屬，篩選出的菌株數量最多；在合肥地區所篩的6株菌株中，分屬于5個菌屬，為青霉屬、木霉屬、枝孢屬、鐮刀菌屬和曲霉屬；在懷寧地區，共篩選出3種菌屬，為鐮刀菌屬，青霉屬和曲霉屬。由表4可知，木霉屬的菌根真菌占所鑒定菌株的29.4%，為優勢種。鐮刀菌屬的真菌侵染，在三個不同地區均有發現，占所篩菌株的23.5%，尤其以宣城為多。曲霉屬的菌根真菌同為亞優勢種，占所篩菌株的23.5%，而其他的菌屬數量則較少。

2.4 拮抗尖孢鐮刀菌的菌根真菌的篩選

取藍莓根系中共篩選出13株菌根真菌 （尖孢鐮刀菌除外），基于對尖孢鐮刀菌的抑菌圈大小初步篩出6株可有效拮抗的菌根真菌，結果見表5。

將此6株菌株進行三組平行試驗，進行后續實驗，以無菌水試片作為空白對照。在30℃恒溫培養72 h，用十字交叉法測抑菌圈直徑（圖4）。

觀察抑菌圈，統計抑菌圈大小，結果如表6所示。

表5 拮抗菌株對尖孢鐮刀菌的抑制作用

圖4 拮抗尖孢鐮刀菌的藍莓菌根真菌的抑菌效果

表6 拮抗菌株對尖孢鐮刀菌的抑制作用

從表6和圖4可知，這6株初篩的拮抗菌株對尖刀鐮刀菌均具有一定的抑菌效果。其中菌株Hfsu02（棘孢木霉）抑菌效果最明顯，抑制圈直徑達到1.72±0.19 cm，通過SPSS進行方差分析后可知六種拮抗菌拮抗作用差異顯著 （f=16.386，p=0.001），Hfsu02的抑菌效果顯著性高于其他菌株（p＜0.05），因此后續實驗選用拮抗菌棘孢木霉Hfsu02進行。

2.5 棘孢木霉Hfsu02的形態特征

棘孢木霉Hfsu02在PDA固體培養基上的菌落形態如圖5所示。

圖5 不同培養時間下棘孢木霉Hfsu02菌落圖片

表7 不同培養時間下棘孢木霉Hfsu02的菌落形態特點

觀察不同培養時間的棘孢木霉Hfsu02的菌落變化特點，其形態變化規律統計如表7。

使用PDA培養基液體搖瓶培養時，棘孢木霉Hfsu02菌絲纏繞形成大小不一的菌絲球 （圖6），培養24 h后，菌絲球呈米粒般大小，表面光滑，呈白色，菌液無色，呈微渾濁狀。培養48 h后，菌絲球體積變大，數量變多，且顏色由白色轉變為乳黃色。溶液由透明色轉為淡黃色，且溶液變渾濁。顯微觀察發現，此時溶液由透明色轉為淡黃色且渾濁，是因為棘孢木霉Hfsu02在培養48 h小時后，在PDA液體培養基中產生了大量分生孢子。在液體培養時易產孢子，也是棘胞木霉的特征之一，目前棘胞木霉工業上主要也是通過優化液體培養條件來獲取大量的孢子懸液[19-20]。因此棘孢木霉Hfsu02也可以通過液體培養來方便的獲取大量孢子，便于生產應用。

由圖6可以看出，棘孢木霉所產分生孢子為圓球形或卵圓形，顏色淡黃至深綠，大小均一，符合棘孢木霉的特征。

圖6 搖瓶培養不同時期棘孢木霉Hfsu02特征

2.6 棘孢木霉在基礎培養基上生長特性研究

棘孢木霉Hfsu02最適宜生長的溫度、pH使用基礎培養基測定。通過單一變量的變化，200 r/min的振蕩培養48 h后測量不同培養條件下30 mL培養基中棘孢木霉Hfsu02菌絲體干重，結果見圖7。

圖7 不同培養條件下棘孢木霉Hfsu02培養48 h菌絲體干重

由圖7-A結果可知，棘孢木霉Hfsu02在不同pH條件下生長狀況不一樣。五種pH下菌體干重的差異達顯著水平（p＜0.05），多重比較后可以得出，pH為4.0時棘孢木霉Hfsu02菌體干重顯著性高于 pH為 3.0、5.0、6.0、7.0時的菌體干重，同時pH為3.0時棘孢木霉Hfsu02菌體干重顯著性低于與其它pH培養下菌體干重，pH為5.0、6.0、7.0時菌體干重差異非顯著性。綜合考慮，基礎培養基pH為4.0時菌體生長狀況最好，為棘孢木霉的Hfsu02最適生長溫度，但當pH小于4.0后對菌體生長有極強的負影響。

由圖7-B結果可知，棘孢木霉在不同溫度下生長速率不一。四種溫度下菌體干重差異達顯著水平（P＜0.05），多重比較后可以得出，在基礎培養基（pH=4.0）培養條件下，培養溫度為25℃時棘孢木霉Hfsu02菌體干重顯著性高于其他溫度，而溫度培養溫度為20℃、30℃和 35℃時，棘孢木霉Hfsu02菌體干重的差異不顯著，綜合考慮，基礎培養基（pH=4.0）培養條件下25℃時菌體生長狀況最好，為棘孢木霉Hfsu02的最適生長溫度。

使用基礎培養基培養棘孢木霉Hfsu02，培養溫度25℃，pH調整為4.0。搖瓶培養體積為30 mL條件下，接種棘孢木霉200 μL均勻孢子懸液（濃度為105/mL），培養后定時定量測得不同時期菌體干重，繪制生長曲線，如圖8所示。

圖8 棘孢木霉Hfsu02優化培養條件下的生長曲線

從圖8可知棘孢木霉在0～8 h期間為延滯期，12～112 h為指數生長期，菌株生長速率較快，112 h之后菌株達到穩定生長期，生長速度緩慢，最高產量為2.76 g/L。

3 討論

菌根真菌可以促進藍莓對營養物質的吸收，并具有對有害微生物的拮抗能力。野生藍莓基本上均侵染了菌根真菌[14]，而在人工種植時，侵染率較低。本研究顯示，宣城地區種植園中紅壤和合肥地區種植園中改良水稻土栽培的藍莓根系的侵染率相對較高，分別為43.33%和36.66%，而懷寧地區紅黃壤中藍莓根系侵染率較低為20.00%，菌根侵染率低于野生環境，這可能是人工種植藍莓易出現各種疾病的原因之一。在選擇藍莓栽培土壤時，可以優先選擇侵染率較高的土壤類型。目前在建設藍莓種植園時，普遍使用硫磺等物質處理土壤，使土壤的理化性質適宜，但是缺少對土壤微生物群落結構維持和改造的考慮。因此，對改造后的土壤，可以考慮加入適當的促生微生物，改善土壤微生物結構，促進藍莓的菌根侵染。

對安徽不同地區的藍莓菌根形態觀察表明，菌根主要表現為外生菌根，但懷寧地區和宣城地區的藍莓根系中也有胞間貫穿菌絲和胞內菌絲團，侵染形式更加多樣。合肥地區的藍莓種植土壤中可考慮加入能形成胞內寄生的菌根真菌，提高侵染的多樣性。本研究從安徽不同地區栽培的藍莓根系中共分離出17株內生菌，共6種菌屬。其中木霉屬（Trichoderma）數量最多，為5株，為安徽藍莓根系中內生的優勢真菌。拮抗實驗表明，大部分的木霉菌均可拮抗尖孢鐮刀菌，是一類促進藍莓抗病性的菌根真菌[21]。4株屬于鐮刀菌屬（Fusarium），各地區藍莓根系中均有發現，說明在安徽各地區，尖孢鐮刀菌的侵染普遍存在，是威脅藍莓健康生長的主要致病菌[22]，對尖孢鐮刀菌的進一步研究對藍莓根腐病的防治提供理論依據。其余4株屬于曲霉屬（Aspergillus），2株屬于青霉屬（Penicillium），1 株屬于枝孢屬（Cladosporium），1株屬于根霉屬（Rhizopus）。青霉屬的菌株一方面可以拮抗其它有害微生物，促進藍莓生長，但在藍莓果實貯藏、運輸的過程中導致果實減產[23]，枝孢屬（Cladosporium）也是一種植物治病菌[24]，可對藍莓病原菌進行治理和防治。

安徽宣城地區的紅壤，所篩菌株數目最多，種類也較豐富。這可能是因為紅壤為酸性土壤，且微生物資源豐富，適宜藍莓種植，對其土壤的人工改造不多，保留了較多的微生物類群。而合肥大圩地區的改良水稻土雖然經過硫磺等化學物質改造，但因為其富含腐殖質，導致侵染的菌根真菌的種類較多。懷寧地區藍莓根系侵染率較低，且分離的菌根真菌種類較少，需要特別注意土壤微生物群落的改造。

藍莓根腐病致病菌大多為尖孢鐮刀菌，故尋找降低甚至殺死尖孢鐮刀菌的生物防治方法方法成為當務之急。目前發現的拮抗尖孢鐮刀菌的生防菌大多為木霉菌、叢枝根菌和芽孢桿菌，而本研究分離的棘孢木霉Hfsu02等多株木霉屬菌根真菌可有效拮抗尖孢鐮刀菌，說明木霉類群普遍在尖孢鐮刀菌的生物防治上具有一定的效果，在藍莓根腐病的生物防治方面，具有較好的應用潛力和應用價值。

棘孢木霉作為生防微生物，在農業生產中有重要作用。為提高棘孢木霉Hfsu02的生長速率，本研究探究了關于以下幾個因素：碳源、氮源、溫度及pH對其生長狀況的影響。研究表明溫度與pH對菌體生長狀況的影響較大，其中最適于棘孢木霉Hfsu02的生長溫度為25℃，最適的pH=4，此結果與李琳等[25]研究的棘孢木霉T31的最適溫度30℃，最適的pH=6不相同，其對酸性條件的適應性和其長期生存在改造后的酸性土壤中（實測pH=3.2）有關。棘孢木霉Hfsu02的最適pH和藍莓對土壤的酸堿性近似，有利于其與藍莓根部的共生，相比其它棘孢木霉，更適用于防治藍莓根腐病。本研究對棘孢木霉Hfsu02最適溫度、最適pH的測定以及其在基礎培養基中液體培養的生長曲線測定，為棘孢木霉Hfsu02的大規模培養和接種提供了理論依據，對擴大藍莓產量和質量，預防藍莓疾病具有重要的應用價值。