MDCK貼壁細(xì)胞中ZO-1蛋白的表達(dá)研究

冶 金，王美皓，敖慧娟，楊 琨，阿依木古麗，喬自林，柏家林*

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心/甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

MDCK細(xì)胞系是由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織中分離培養(yǎng)所建立[1]，其在培養(yǎng)過程中合成緊密連接（tight junction, TJ）蛋白分泌至細(xì)胞表面形成單細(xì)胞層[2]，呈上皮樣細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，通常為貼壁培養(yǎng)并且能連續(xù)傳代。隨著國內(nèi)外大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟和被應(yīng)用，流感病毒疫苗的制備也逐漸由哺乳動物細(xì)胞系取代傳統(tǒng)雞胚為生產(chǎn)基質(zhì)[3]，其中MDCK細(xì)胞由于對不同流感病毒株具有易感染、易培養(yǎng)、增殖快且病毒不易變異等特點(diǎn)[4]，被公認(rèn)為是最適于流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞系之一[5]。

緊密連接是上皮細(xì)胞間的一種重要連接方式[6]，主要由TJ蛋白組成，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞旁離子和溶質(zhì)分子的跨膜運(yùn)輸以及維持細(xì)胞極性狀態(tài)[7]，在細(xì)胞中最初發(fā)現(xiàn)緊密連接就是由于其可通過細(xì)胞旁路途徑控制滲透作用[8]。1986年Steveson[9]首次發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞緊密連接相關(guān)的蛋白ZO-1（zonula occludens-1，閉鎖小帶蛋白1），同時有研究發(fā)現(xiàn)在無緊密連接的非上皮細(xì)胞中也存在ZO-1蛋白的表達(dá)，與粘附連接直接相連[10]。上皮細(xì)胞中的ZO-1蛋白則通過跨膜蛋白連接至細(xì)胞骨架處[11]，在TJ蛋白的形成、維持上皮組織正常結(jié)構(gòu)和功能以及調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和遷移等生理活動中發(fā)揮重要作用[12]，與細(xì)胞成瘤性有著密切關(guān)系。

本文擬通過應(yīng)用免疫組化及熒光染色檢測MDCK貼壁細(xì)胞中ZO-1蛋白表達(dá)情況，為研究MDCK貼壁細(xì)胞內(nèi)源性蛋白表達(dá)及功能作用提供數(shù)據(jù)支持，為探究ZO-1蛋白與MDCK細(xì)胞的成瘤性作用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 MDCK貼壁細(xì)胞，由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶和PBS（蘭州百靈生物技術(shù)有限公司）；新生牛牛血清（蘭州民海生物有限公司）；4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）；閉鎖小帶蛋白1抗體、SP免疫組化試劑盒、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、DAPI染液和免疫熒光抗淬滅封片劑（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒和Mayer蘇木素染液（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞爬片制備 將經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片置于6孔板中，按1×106/ml 的細(xì)胞密度將已消化的細(xì)胞接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h左右。

1.2.2 SP法免疫組化染色 將細(xì)胞爬片從培養(yǎng)板中取出，PBS清洗；滴加4%多聚甲醛室溫固定20 min；滴加0.5%Triton X-100通透20 min；滴加3%H2O2，室溫孵育15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后滴加封閉用正常山羊血清工作液，37℃ 孵育20 min；用吸水紙吸去封閉液；滴加稀釋度為1:100的閉鎖小帶蛋白1抗體，37℃ 孵育2 h；滴加生物素化二抗工作液，37℃ 孵育20 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃ 孵育20 min；顯色液DAB顯色，蘇木素復(fù)染后在顯微鏡下觀察并進(jìn)行封片。

1.2.3 免疫熒光染色 將細(xì)胞爬片從培養(yǎng)板中取出，PBS清洗；滴加4%多聚甲醛室溫固定20 min；滴加0.5%Triton X-100通透20 min；滴加3%H2O2，室溫孵育15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后滴加封閉用正常山羊血清工作液，孵育20 min；用吸水紙吸去封閉液；滴加稀釋度為1:100的閉鎖小帶蛋白1抗體，37℃ 孵育2 h；滴加稀釋度為1:100的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG 熒光二抗于37℃ 避光孵育1 h；滴加DAPI染液室溫孵育5 min，PBS清洗（×4）；用吸水紙吸去細(xì)胞爬片上的液體，使用免疫熒光抗淬滅封片劑封片后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 SP免疫組化法檢測ZO-1蛋白在MDCK貼壁細(xì)胞中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)陰性對照使用PBS為一抗對MDCK貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示ZO-1蛋白主要在胞核及胞漿中表達(dá)，呈棕褐色、淺褐色顆粒。通過免疫組化圖可以觀察出，ZO-1蛋白在胞核中表達(dá)較多，顏色較深，在胞漿中表達(dá)較少，顏色較淺，詳見圖1。

圖1 免疫組化染色結(jié)果

2.2 免疫熒光染色檢測ZO-1蛋白在MDCK貼壁細(xì)胞中的表達(dá)

為確認(rèn)免疫組化染色結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用免疫熒光染色檢測ZO-1蛋白在MDCK貼壁細(xì)胞中的表達(dá)情況。經(jīng)DAPI染色后在顯微鏡下可觀察到藍(lán)色熒光的細(xì)胞，正常細(xì)胞核核形完整，染色質(zhì)均勻，非正常細(xì)胞核破裂成碎片，染色質(zhì)固縮，向外周聚集成周邊化。與ZO-1蛋白Ⅰ抗和帶有FITC特異標(biāo)記的Ⅱ抗結(jié)合后，含有ZO-1蛋白的細(xì)胞會發(fā)綠色熒光為陽性，無ZO-1蛋白的無綠色熒光為陰性。在細(xì)胞核中可見強(qiáng)度較強(qiáng)的綠色熒光，胞漿中也有綠色熒光出現(xiàn)，但強(qiáng)度不強(qiáng)。結(jié)果表明ZO-1蛋白在MDCK貼壁細(xì)胞中胞核表達(dá)高于胞漿表達(dá)。

圖2 免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

ZO-1不僅構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接，而且間接參與細(xì)胞骨架形成，已有研究證明ZO-1與腫瘤細(xì)胞的初發(fā)及擴(kuò)散存在密切聯(lián)系[13]，其表達(dá)異常可引起緊密連接結(jié)構(gòu)與功能異常并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)MDCK貼壁細(xì)胞正常培養(yǎng)狀態(tài)下，胞核ZO-1蛋白表達(dá)強(qiáng)，可能說明ZO-1蛋白在其細(xì)胞致瘤性方面發(fā)揮作用。Balda等發(fā)現(xiàn)ZO-1與腫瘤分化程度相關(guān)，可能是由于細(xì)胞連接中ZO-1蛋白的減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散能力的增強(qiáng)[14]；Tada等發(fā)現(xiàn)在大鼠腦動脈瘤的發(fā)生中觀察到了ZO-1蛋白的表達(dá)減少，并認(rèn)為其與內(nèi)皮細(xì)胞損傷和巨噬細(xì)胞的遷移有關(guān)[15]。

MDCK細(xì)胞作為生產(chǎn)流感病毒疫苗的最適細(xì)胞系，成瘤性強(qiáng)弱亦是影響其生物制品質(zhì)量關(guān)鍵，已確定ZO-1蛋白在MDCK貼壁細(xì)胞中表達(dá)，但ZO-1是否影響MDCK細(xì)胞成瘤還需進(jìn)一步研究。