Fascin、HPA蛋白在丙泊酚抑制人胃癌MKN-45細胞轉移中的作用

賴曉紅，梁 樺，劉洪珍，王漢兵，李露君

(廣東省佛山市第一人民醫院麻醉科 528000)

胃癌是常見的惡性腫瘤，由胃癌導致的死亡人數在惡性腫瘤中位居第二，僅次于肺癌，而大多數胃癌患者被發現時往往已處于胃癌晚期[1]。手術是胃癌最重要的治療方法之一。丙泊酚是胃癌根治術中常用的靜脈麻醉藥，而關于丙泊酚對腫瘤細胞的作用結果不一致[2-4]。筆者前期研究表明丙泊酚可抑制體外培養的人胃癌MKN-45細胞的轉移能力[5]，但具體機制不明。本研究擬探討丙泊酚抑制人胃癌MKN-45細胞轉移能力與Fascin、HPA蛋白表達的相關性，為胃癌患者在麻醉期間用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑和儀器 胃癌MKN-45細胞(中國科學院上海細胞生物醫學研究所)，胎牛血清、DMEM高糖培養基、RPMI-1640培養基(Hyclone公司,美國)，丙泊酚(阿斯利康公司，批號NJ059，英國)，Transwell小室(Corning公司，美國)，Matrigel膠(BD公司，美國)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，美國)，兔抗人Fascin蛋白多克隆抗體(CST公司，美國)，兔抗人HPA多克隆抗體、鼠抗人GAPDH抗體(Santa Cruz公司，美國)，倒置光學顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2細胞培養 準備好含10 %的胎牛血清，且每毫升含100 U青霉素和100 U鏈霉素的DMEM高糖培養基，將符合細胞計數要求的人胃癌MKN-45細胞放入培養基，并放入條件為37 ℃、含5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。每3～4天用含0.02% 乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶溶液消化，以1∶3傳代培養。

1.3丙泊酚干預 細胞培養24 h后，細胞分為5組，分別為加入4、8、16 μg/mL丙泊酚的P4、P8、P16組，不做干預的空白對照組(C組)和丙泊酚的溶劑脂肪乳組(I組)，以上處理時間均為24 h。

1.4細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力 在6孔板背后用標記筆均勻地劃上橫線，每道橫線相隔5 mm，橫穿過孔，每孔5條線。每組取6個培養孔。各組細胞處理后換液，再用絲裂霉素處理1 h。用20 μL移液器槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線進行細胞劃痕。洗滌3次后加入無血清培養基并拍照，此時的劃痕距離為T0，放入37 ℃、含5% CO2培養箱繼續培養24 h后再拍照，此時的劃痕距離為T24。計算細胞遷移率=(T0-T24)/T0×100%。

1.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 于4 ℃溶解Matrigel膠24 h后，取40 μL，加入預冷的Transwell小室，上室和下室用孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔膜分隔，于37 ℃下聚合30 min以凝固Matrigel膠。吸走小室中多余的液體，在上室加100 μL無血清RPMI-1640培養基、下室加入600 μL含血清的RPMI-1640培養基，于37 ℃下放置12 h后洗滌。消化各組MKN-45細胞，每組取6個復孔，用含0.2%牛血清清蛋白(BSA)的培養基重懸，收集細胞。以每室100 μL 的量分別加入上室， 于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養24 h后取出小室，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌1次，加入0.5%結晶紫染色10 min，后用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞，于倒置光學顯微鏡下觀察，計數下室的細胞數(即穿過濾膜的細胞數)，隨機選取5個視野，取其平均值。

1.6Western blot法檢測人胃癌MKN-45細胞中Fascin、HPA蛋白的表達 胰酶消化收集各組細胞，離心10 min后棄培養液，用PBS清洗，再加入100 μL的細胞裂解液裂解細胞，離心5 min后，取上清液。BCA法進行蛋白定量。取10 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后沖洗凝膠，將蛋白轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(含0.1% Tween 20)封閉，后分別加入1∶500稀釋的兔抗人Fascin多克隆抗體，1∶500稀釋的兔抗人HPA蛋白多克隆抗體，內參為1∶1 000稀釋的鼠抗人GAPDH，于24 ℃下孵育4 h，用含0.1%Tween20的TBST洗膜3次，每次15 min，加入1∶2 000辣根過氧物酶體HRP標記的二抗，24 ℃作用1 h，后用TBST避光洗膜3次，每次15 min，后放置暗盒中顯影。掃描PVDF膜，進行吸光度(A)值分析，將Fascin和HPA的A值與GAPDH的A值對比，其比值反映Fascin和HPA蛋白相對表達水平。

2 結 果

與C組比較，P4、P8、P16組細胞的遷移能力和侵襲能力降低(P<0.05)，I組上述指標差異無統計學意義(P>0.05)；隨著丙泊酚濃度的增加，細胞的遷移能力和侵襲能力逐漸降低(P<0.05)，見表1，圖1、2。與C組比較，P4、P8、P16組Fascin和HPA蛋白表達下調(P<0.05),I組上述指標均差異無統計學意義(P>0.05)；隨著丙泊酚濃度的增加，Fascin和HPA蛋白的表達逐漸下調(P<0.05),見圖3、表2。

圖1 各組人胃癌MKN-45細胞的遷移能力檢測(×40)

A：C組；B：I組；C：P4組；D：P8組；E：P16組

圖2各組人胃癌MKN-45細胞侵襲能力檢測(Transwell×200)

表1 各組細胞24 h遷移與侵襲能力

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與P4組比較；c：P<0.05，與P8組比較

圖3 各組人胃癌MKN-45細胞Fascin和HPA蛋白Western blot圖

組別FascinHPAC組0.87±0.121.97±0.33I組0.98±0.112.08±0.28P4組0.49±0.13a1.49±0.27aP8組0.27±0.06ab1.01±0.14abP16組0.11±0.02abc0.53±0.16abc

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與P4組比較；c：P<0.05，與P8組比較

3 討 論

細胞劃痕實驗可模擬腫瘤細胞遷移的過程，在一定程度上是評價體外腫瘤細胞遷移能力的有效方法；Transwell實驗中小室上、下室之間的基質膠與細胞外基質的結構相似，腫瘤細胞分解并穿過基質膠的能力反映了細胞的侵襲能力[6-7]。本研究結果表明，丙泊酚可抑制體外培養的人胃癌MKN-45細胞的遷移和侵襲，且隨著丙泊酚濃度的增加，細胞的遷移和侵襲能力逐漸降低，這與筆者前期的研究結果一致[5]。腫瘤細胞轉移是癌癥患者死亡的重要原因。腫瘤細胞分泌蛋白酶降解細胞外基質和基底膜發生的侵襲過程，以及游離出細胞外基質后發生的遷移過程，是轉移能否成功的兩個較為關鍵因素[8]。因此，抑制腫瘤細胞遷移和侵襲是防止腫瘤細胞轉移的重要手段[9]。Fascin蛋白是一種細胞骨架蛋白，在細胞遷移、黏附和細胞間相互作用中起重要作用，在正常上皮結構中幾乎檢測不到，但在胃癌患者中高度表達。Fascin蛋白的過度表達與胃癌患者的不良預后呈正相關；在小鼠的實驗模型中，抑制Fascin蛋白的表達，可抑制腫瘤細胞遷移和體外侵襲，從而減少腫瘤的轉移[10-11]。HPA蛋白是一種內-B-D-葡萄糖醛酸苷酶，具有切割細胞表面和細胞外基質中硫酸乙酰肝素的能力，而硫酸乙酰肝素則起著維持細胞外基質穩定性的重要作用，同時HPA蛋白可重塑細胞基底膜的結構，這有利于腫瘤細胞穿破細胞外基質和血管壁，促進腫瘤細胞的侵襲。HPA蛋白在很多腫瘤患者中均高度表達，包括結腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌等[12-13]。本研究結果提示，經丙泊酚處理后的人胃癌MKN-45細胞遷移和侵襲能力下降，并隨著丙泊酚濃度的增加，其遷移和侵襲能力逐漸下降，同時Fascin、HPA蛋白表達也逐漸下調，提示丙泊酚抑制人胃癌MKN-45細胞轉移的作用可能與其下調人胃癌MKN-45細胞中Fascin、HPA蛋白表達，進而抑制細胞的遷移和侵襲能力有關。

綜上所述，丙泊酚可呈濃度依賴性地抑制人胃癌MKN-45細胞的遷移和侵襲，其機制可能與下調Fascin和HPA蛋白的表達有關。