頭孢他啶納米粒包被導(dǎo)管對(duì)銅綠假單胞菌介導(dǎo)小鼠導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染的影響*

馮 偉，王 瑜，張定林，李曉宇,3，孫鳳軍△

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科,重慶 400038；2.陸軍軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部化學(xué)教研室,重慶 400038；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第980醫(yī)院邯鄲院區(qū)藥劑科,河北邯鄲 056001)

尿道導(dǎo)管主要用于手術(shù)期間收集尿液和測(cè)量ICU患者的尿量或長(zhǎng)期用于治療輸尿管梗阻、尿滯留和尿失禁[1]。伴隨醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步患者使用尿道導(dǎo)管的比例不斷增高，同時(shí)使用尿道導(dǎo)管導(dǎo)致的導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染(catheter associated urinary tract infection,CAUTI)也越來越多，尤其是細(xì)菌生物膜感染。在ICU，超過39%的CAUTI是由銅綠假單胞菌和大腸埃希菌引起的[2-3]。而細(xì)菌一旦形成生物膜，即可逃避宿主免疫反應(yīng)的攻擊和抗菌藥物的殺滅，而一旦條件合適，細(xì)菌生物膜就可發(fā)生播散，導(dǎo)致慢性感染或感染復(fù)發(fā)，給臨床治療帶來了極大困難[4-5]。

抗菌藥物通過全身性使用會(huì)導(dǎo)致耐藥菌和藥物不良反應(yīng)的出現(xiàn)[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道通過廣譜抗菌藥物涂抹生物材料來防止細(xì)菌的黏附、定植和生物膜形成[7]。對(duì)于短期尿道插管，已有呋喃西林或銀合金浸漬導(dǎo)管控制尿路感染的相關(guān)報(bào)道。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)在體外可以顯著抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成[8]，然而關(guān)于體內(nèi)研究目前尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以雌性C57BL/6系小鼠為動(dòng)物模型，考察CAZ納米粒包被導(dǎo)管對(duì)銅綠假單胞菌引起的CAUTI的影響，為臨床治療CAUTI提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株及動(dòng)物來源 銅綠假單胞菌PAO1保存于陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥理基地。C57BL/6系雌性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20 g左右，來自陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑及設(shè)備 CAZ(中國食品藥品檢定研究院)，MH瓊脂(英國Oxoid公司)，LB培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (PLGA，50∶50)、脫氧膽酸鈉(美國Sigma公司)，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯 (HS15，德國BASF公司)，醫(yī)用級(jí)硅膠導(dǎo)管(型號(hào)SIL025，美國Braintree Scientific公司)，PE-10聚乙烯管(美國BD公司)，高效液相色譜儀(HPLC，美國Waters公司)，超聲波破碎儀(美國Sonics公司)。

1.3方法

1.3.1CAZ納米粒的制備及濃度測(cè)定 將20 mg PLGA溶于1 mL氯仿中，將2 mg CAZ、0.5%脫氧膽酸鈉和0.5% HS15溶于10 mL超純水中，將有機(jī)相加入水相中，探頭超聲攪拌10 min，功率45%，超聲間隔每次5 s，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，溶液由白色乳狀液變?yōu)閹в腥楣獾某吻迦芤杭吹肅AZ納米粒。采用HPLC測(cè)定CAZ在PLGA納米粒中的含量。取制備好的納米粒溶液100 μL，加入900 μL 乙腈溶液破乳，混合均勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：色譜柱為Diamonsil 反相C18柱(250.0 mm×4.6 mm×5.0 μm)，流動(dòng)相為乙腈-含0.05 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖鹽溶液(pH=2.5，體積比10.4∶89.6)，流速為1.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL。另取100 μL納米粒溶液稱質(zhì)量，計(jì)算載藥量。納米粒載藥量=包裹在納米粒中的藥物含量/稱取的納米粒質(zhì)量×100%。

1.3.2CAZ納米粒包被導(dǎo)管及表面藥物含量測(cè)定 將無菌的4～6 mm硅膠導(dǎo)管浸入載有CAZ的PLGA納米粒溶液中，浸泡1 h后取出，于37 ℃干燥過夜。為獲得均勻致密的涂層，重復(fù)此過程 3次。上述過程均在無菌層流條件下完成。之后將導(dǎo)管用去離子水沖洗后于室溫干燥至少2 h，備用。 取1 cm CAZ納米粒包被導(dǎo)管浸入含有2 mL乙腈的燒杯中，破乳使藥物釋放出來。將導(dǎo)管置于乙腈溶液中室溫放置24 h。之后將導(dǎo)管取出放入新鮮的乙腈溶液中，使藥物繼續(xù)釋放。重復(fù)該過程3次，確保藥物釋放完全。合并3次的藥物溶液，取1 mL過濾進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定藥物總量。

1.3.3CAZ納米粒包被導(dǎo)管的體外釋藥率 取 3 段1 cm CAZ納米粒包被導(dǎo)管分別置于含有20 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)的離心管中，將離心管置于恒溫?fù)u床中，每天自離心管中取出 4 mL 液體,共取7 d， 用HPLC測(cè)定溶液中CAZ含量，同時(shí)立即向離心管中補(bǔ)加4 mL同溫度的新鮮介質(zhì)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中CAZ的濃度及累計(jì)釋放率。取3份樣本的平均值繪制導(dǎo)管表面CAZ的累積釋放曲線圖。體外CAZ釋放率=釋放介質(zhì)中 CAZ含量/導(dǎo)管上CAZ總量。

1.3.4CAZ納米粒包被導(dǎo)管的體外抑菌活性 挑取銅綠假單胞菌PAO1單菌落接種于LB肉湯中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。 用無菌生理鹽水稀釋菌液至0.5×108CFU/mL，然后用無菌棉簽蘸取菌液涂布在MH瓊脂平板上。使用無菌鑷子分別將1 cm不含有CAZ的導(dǎo)管和1 cm CAZ納米粒包被尿管輕輕放置在MH瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。通過測(cè)量和記錄導(dǎo)管周圍的抑菌圈評(píng)估其抗菌活性。然后將導(dǎo)管取出并轉(zhuǎn)移至新鮮的MH瓊脂平板，確保導(dǎo)管的同一側(cè)與瓊脂接觸， 重復(fù)如此操作至第7天，記錄每天抑菌圈大小。

1.3.5小鼠CAUTI模型的建立 (1)菌液制備：將無菌導(dǎo)管放入24孔板中，銅綠假單胞菌PAO1過夜培養(yǎng)物用LB 稀釋1 000倍，然后取1 mL稀釋菌液加入24孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h。將導(dǎo)管表面的生物膜洗脫下來，稀釋至1×108CFU/mL用于體內(nèi)試驗(yàn)。(2)感染模型建立：4～6 mm長(zhǎng)的硅膠導(dǎo)管安裝在6～8 mm長(zhǎng)的PE-10聚乙烯管上，后者再連接到魯爾接頭適配器上。 整個(gè)裝配浸泡在70%乙醇中，空氣干燥后用紫外線消毒約2 h。每只小鼠尿道區(qū)域用75%乙醇擦拭，膀胱排空尿液。將帶有硅膠導(dǎo)管和PE-10聚乙烯管的適配器輕輕地插入小鼠的尿道口。PE-10聚乙烯管用鑷子輕輕推進(jìn)。硅膠導(dǎo)管被釋放到膀胱中，小心取出帶有PE-10聚乙烯管的適配器，從而將硅膠管留在膀胱中。在膀胱內(nèi)植入硅膠導(dǎo)管后，將50 μL PBS或銅綠假單胞菌PAO1菌液經(jīng)尿道導(dǎo)管接種到膀胱中。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，小鼠體內(nèi)植入未包被的導(dǎo)管；CAZ處理組：小鼠體內(nèi)植入CAZ納米粒包被導(dǎo)管。所有小鼠在感染后的指定時(shí)間脫頸處死。每組每天處死5只小鼠，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6膀胱組織和導(dǎo)管表面細(xì)菌菌落計(jì)數(shù) 經(jīng)下腹部正中線切口迅速取出膀胱，稱質(zhì)量，加入1 mL生理鹽水，用研磨器研磨成勻漿。導(dǎo)管取出后放入裝有1 mL生理鹽水的離心管中，超聲處理15～20 min，然后渦旋混勻。用生理鹽水按照10倍濃度梯度將組織或?qū)Ч苓M(jìn)行稀釋，取每個(gè)濃度稀釋液1 mL分裝于無菌培養(yǎng)皿中，再加入9 mL無菌的LB固體培養(yǎng)基混勻，37 ℃培養(yǎng)過夜。采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.3.7膀胱組織病理觀察[蘇木素-伊紅(HE)染色] 首先使用梯度乙醇為膀胱組織脫水，每次30 min。脫水完成后， 用二甲苯透明；將已經(jīng)透明后的組織塊置于已經(jīng)融化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織后進(jìn)行包埋；將包埋好的石蠟塊固定于切片機(jī)上，切成5～8 μm厚的薄片。切下的薄片往往皺褶，需放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干；用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)梯度乙醇脫水，最后入蒸餾水，就可行HE染色；染色后的切片經(jīng)100%乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯透明，樹膠封片，蓋上蓋玻片，貼標(biāo)簽，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.8細(xì)胞因子定量免疫分析 采用ELISA試劑盒對(duì)小鼠膀胱組織勻漿上清液白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-10細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1CAZ納米粒載藥量及導(dǎo)管表面藥物總量的測(cè)定 經(jīng)HPLC測(cè)定，載CAZ的PLGA納米粒載藥量為(6.56±1.24)%，每1厘米導(dǎo)管表面所含藥物總量為(10.48±0.04)μg。

2.2CAZ納米粒包被導(dǎo)管的體外釋藥率 結(jié)果顯示，7 d內(nèi)導(dǎo)管表面CAZ累積釋放量為71.34%。其中前4 d釋放速度較快，累積釋放量達(dá)到64.46%，見圖1。

圖1 CAZ納米粒包被導(dǎo)管的體外藥物累積釋放量

2.3CAZ納米粒包被導(dǎo)管的體外抑菌活性檢測(cè) 未包被導(dǎo)管7 d內(nèi)均無抑菌圈出現(xiàn)，而CAZ納米粒包被導(dǎo)管周圍抑菌圈大小在(17.7±2.2)～(28.2±3.3) mm，表明CAZ納米粒包被導(dǎo)管具有較好的抗菌作用，見圖2。

圖2 CAZ納米粒包被導(dǎo)管對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌活性

2.4膀胱組織和導(dǎo)管表面細(xì)菌菌落計(jì)數(shù) 采用菌落平板計(jì)數(shù)法對(duì)小鼠的膀胱組織和導(dǎo)管表面進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析，空白對(duì)照組小鼠膀胱組織平均細(xì)菌量增加，從感染后第1天的3.8 logCFU/g到第7天的7.1 logCFU/g；然而CAZ處理組在感染后第1～4天小鼠膀胱組織細(xì)菌平均值小于1.0 logCFU/g，第7天未檢測(cè)到細(xì)菌(圖3A)。空白對(duì)照組導(dǎo)管表面細(xì)菌數(shù)從第1天的4.9 logCFU/植入物增加到第7天的6.5 logCFU/植入物；相反，CAZ的存在限制了細(xì)菌在植入物表面上的定植，第1～7天導(dǎo)管表面的細(xì)菌數(shù)均小于1.0 logCFU /植入物(圖3B)。

A：膀胱組織；B：導(dǎo)管表面；a:P<0.01,與空白對(duì)照組比較

圖3小鼠膀胱組織和植入物表面細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.5小鼠膀胱組織病理觀察結(jié)果 在感染后第1天，空白對(duì)照組小鼠膀胱組織有上皮細(xì)胞脫落，且伴有中性粒細(xì)胞浸潤(圖4A)，而CAZ處理組小鼠膀胱表現(xiàn)出上皮細(xì)胞有部分脫落，出現(xiàn)輕微炎癥(圖4B)。7 d后，空白對(duì)照組小鼠膀胱有大量上皮細(xì)胞脫落、壞死，并伴有中性粒細(xì)胞浸潤，存在水腫(圖4C)，但是CAZ處理組膀胱炎癥細(xì)胞部分增加，膀胱組織比較完整，沒有明顯的炎癥信號(hào)(圖4D)。

2.6細(xì)胞因子水平定量免疫分析 空白對(duì)照組小鼠膀胱組織促炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平隨感染后天數(shù)增加而升高，且CAZ處理組兩種細(xì)胞因子水平顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)。然而，空白對(duì)照組抗炎性細(xì)胞因子IL-10水平雖然隨感染后天數(shù)增加而升高，但CAZ處理組IL-10水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，見圖5。

A:空白組感染第1天；B：CAZ處理組感染第1天；C：空白組感染后第7天；D：CAZ組感染第7天

圖4小鼠膀胱組織石蠟切片HE染色(×100)

A：IL-6；B：TNF-α;C：IL-10；a：P<0.01,與空白對(duì)照組比較

圖5小鼠膀胱IL-6、TNF-α和IL-10細(xì)胞因子水平測(cè)定

3 討 論

尿路感染(UTI)是醫(yī)院獲得性感染最常見的類型之一，約80%院內(nèi)尿路感染與尿道插管有關(guān)，尿道導(dǎo)管內(nèi)缺乏免疫，益于細(xì)菌定值，為尿路致病菌進(jìn)入膀胱創(chuàng)造了條件[9-10]。由于銅綠假單胞菌能夠在尿道導(dǎo)管表面形成難以清除的生物膜，因此銅綠假單胞菌介導(dǎo)的CAUTI的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。本研究中的藥物釋放數(shù)據(jù)顯示CAZ納米粒包被導(dǎo)管能夠持續(xù)釋放藥物，且釋放濃度高于其最小抑菌濃度(MIC)，可有效預(yù)防CAUTI，而且即使藥物以亞MIC濃度釋放時(shí)也可避免耐藥的發(fā)生。體外抑菌活性檢測(cè)結(jié)果顯示CAZ可以保持較強(qiáng)的抗菌活性，表明導(dǎo)管表面的藥物可以持續(xù)釋放。這與其他抗菌藥物涂抹導(dǎo)管的抗菌作用相似[11]。

膀胱組織中的細(xì)菌數(shù)量與所有時(shí)間點(diǎn)取出的植入物表面的細(xì)菌量相關(guān)。有研究報(bào)道腸球菌感染小鼠膀胱炎模型中，膀胱植入尿道導(dǎo)管7 d后其膀胱和腎臟中細(xì)菌數(shù)增加及植入物表面生物膜形成增加[12]，這與本研究結(jié)果一致。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道兔子CAUTI模型中羥磷灰石納米粒包被導(dǎo)管表面生物膜形成較未包被導(dǎo)管減少和尿路上皮組織無明顯病理特征[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)CAZ納米粒包被導(dǎo)管后其更能抵抗細(xì)菌定植和生物膜形成。病理切片結(jié)果顯示CAZ納米粒包被植入物幾乎不影響膀胱組織病理，其異物介導(dǎo)的輕微炎癥歸因于宿主的免疫反應(yīng)，它能夠克服未包被植入物引起的嚴(yán)重炎癥，并不出現(xiàn)水腫、淋巴細(xì)胞增多等癥狀。提示CAZ納米粒包被導(dǎo)管在預(yù)防和治療銅綠假單胞菌引起的CAUTI方面具有一定的臨床療效。

宿主對(duì)銅綠假單胞菌引起的尿路感染的有效防御主要取決于非特異性抗菌防御機(jī)制[14]。TNF-α 和 IL-6 是重要的炎癥介質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，在機(jī)體的抗感染中參與免疫反應(yīng)，是引起免疫細(xì)胞發(fā)生功能紊亂的重要促發(fā)因子，最終可導(dǎo)致重要器官的衰竭。IL-10是一種具有抗炎、抗免疫和抗纖維化作用的免疫抑制性因子，通過抑制Th1細(xì)胞的增殖而發(fā)揮其抗炎作用。有研究報(bào)道在糞腸球菌感染的小鼠CAUTI模型中，膀胱植入導(dǎo)管后IL-1β、IL-6、IL-12和IL-17炎癥因子表達(dá)均上調(diào)[15]。本研究膀胱組織中細(xì)胞因子水平檢測(cè)結(jié)果顯示植入CAZ納米粒包被導(dǎo)管后降低了植入物介導(dǎo)的炎癥作用，提示CAZ納米粒包被導(dǎo)管提高了宿主對(duì)感染的免疫反應(yīng)。總之，本研究顯示CAZ納米粒包被導(dǎo)管可以在體內(nèi)釋放有效的藥物濃度而防止銅綠假單胞菌的黏附和生物膜形成，因此為臨床醫(yī)生有效控制銅綠假單胞菌引起的CAUTI帶來了希望，同時(shí)也為抗菌藥物納米粒包被導(dǎo)管治療其他尿路致病菌引起的各種疾病提供了參考依據(jù)。