HPLC法測定皮革及皮革制品中防霉劑吡啶硫銅鋅含量

楊藝歡

(廣東省惠州市質量計量監督檢測所 輕化室，廣東 惠州 516000)

皮革因富含蛋白質，是微生物生長的天然培養基。因此，皮革的防腐防霉工藝一直深受重視。目前最常用的方法是添加防腐防霉劑，如甲醛、酰胺類、季銨鹽類和雜環類化合物等[1]。吡啶硫銅鋅(ZPT)作為一種高效的廣譜殺菌劑應用廣泛，因其高效、低毒、使用安全等性質被廣泛應用于各行各業中[2]。但近年來有研究表明，長期接觸ZPT易誘發人體過敏性、接觸性皮炎，對人體健康及生態環境造成一定壓力。國內外關于吡硫鎓鋅的檢測方法主要是關于化妝品中的去屑成分，在國家食品藥品監督管理總局組織完成的《化妝品安全技術規范》(2015年版)中規定淋洗類產品中限量要求為1.5%。目前，國內外都沒有針對皮革及皮革制品中ZPT含量檢測的標準，因此有必要建立一種針對性強、靈敏度高、回收率高、快速的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 測定原理

在酸性條件下，樣品經正己烷脫脂后，用甲醇超聲提取，經高效液相色譜儀分離，二極管陣列檢測器檢測，根據保留時間和光譜圖定性，峰面積定量，以標準曲線法計算ZPT含量。

1.2 主要實驗儀器

高效液相色譜 (美國安捷倫公司)；超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；IQ7000純水機(美國Milli-Q公司)。

1.3 試劑

吡啶硫銅鋅標準品(純度>99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；甲醇(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；乙腈(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；實驗用水為二級蒸餾超純水。

標準溶液的配制：準確稱取0.03000g標準物質于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即配成濃度為600μg/mL標準溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.8mm×250 mm,5μm)；

流動相：甲醇，加入0.05mmol/L的EDTA，用磷酸調節至pH值至4.0～4.5之間；

檢測器：二極管陣列檢測器；

波長：340nm；

流速：1.0mL/min；

柱溫：30℃；

進樣量：10μL。

1.5 樣品前處理

脫脂：將皮革或皮革制品剪成小于5mm×5mm的碎片后，準確稱取1.000g，加入20mL正己烷，于40℃超聲波中提取30min，倒掉正己烷，重復上述步驟一次，脫脂后敞口放置過夜，揮干正己烷。

萃取：往提取器中準確加入10.0mL甲醇，旋緊蓋子，在40℃超聲波中提取30min，冷卻至室溫，經0.22μm濾膜過濾，試液供測定用。

2 結果與分析

2.1 樣品處理的優化

皮革及皮革制品的主要組成包括蛋白質、纖維、無機鹽、油脂等，結構緊密，不溶于水，這些基質的存在不但會干擾ZPT的提取，而且容易污染儀器。因此，在目標物提取時需先進行純化。甲醇和乙腈能使少量蛋白質沉淀，但由于乙腈的極性小于甲醇，在反相中洗脫能力要強于甲醇，因ZPT本身的出峰時間較早，因此用甲醇作溶劑更合適。通過超聲提取目標物后，經0.22μm濾膜過濾后上機測定。該方法操作簡單，回收率高，靈敏度高，滿足定性和定量要求。

本方法探討了脫脂對目標物提取的影響。本實驗對以下兩種情況進行分析，分別是樣品先經正己烷脫脂再用甲醇提取，與樣品直接用甲醇進行提取。實驗證明，前者比后者出峰雜質要少，這說明脫脂處理對目標物質的提純具有良好的效果。

本方法探討了流動相的選擇對分析結果的影響。實驗證明，當流動相的pH值為6.0～7.0時，ZPT出現異常峰-雙峰；當調節流動相的pH值為4.0～4.5時，峰形雖得到一定的改善，但仍有拖尾和雙峰現象。在流動相中加入比例為0.05mmol/L的EDTA，且pH值調節為4.0～4.5時，色譜峰形尖銳、對稱，柱效大大提高。這說明在酸性條件下，在流動相中加入一定比例的EDTA，目標物分析效果良好。

2.2 線性范圍與檢出限

逐級稀釋配備標準溶液7個點，經測定，標準溶液在(3～120)μg/mL范圍內呈良好線性關系，相關系數r2=0.999。以不含ZPT的牛皮作為本底，當添加濃度為1μg/mL時，信噪比S/N=67.7>3。結果表明，設定最低檢出限1μg/mL符合要求。

2.3 精密度實驗

對一個樣品重復測定7次，通過峰面積計算平均值、標準偏差和相對標準偏差(RSD)。本實驗測定的RSD<5%，實驗證明該方法的流動相及色譜條件的選擇對目標物的測定具有良好的分析效果。精密度數據如表1所示。

表1 精密度測試測定結果Table1 The precision data

2.4 回收率試驗

表2 加標回收率試驗結果Table 2 The recovery data

選取不含ZPT的牛皮作為本底，添加3個水平的加標回收試驗，每個水平進行2次平行測定，測定數據見表2。試驗結果表明，回收率均大于85%，表明本實驗的前處理方法能對目標物起到很好的提純作用。

2.5 實際樣品檢測

隨機抽取20份皮革或皮革制品，按照本研究建立的方法進行檢測ZPT含量。其中1份樣品檢出少量ZPT，其余19份樣品未檢出。經分析，陽性樣品的光譜圖匹配度為977，色譜圖和光譜圖如圖1所示。

圖1 陽性樣品色譜圖與光譜圖Fig.3 Chromatogram and spectra of positive sample

3 結論

本試驗建立了外標法定量，高效液相色譜法測定皮革及皮革制品中防霉劑吡啶硫銅鋅含量。樣品用正己烷脫脂，用甲醇作為提取后，經HPLC-DAD檢測。該方法的檢出限為1μg/mL，定量下限為3 μg/mL，線性范圍(3～120) μg/mL，相關系數為r2=0.999。該方法前處理簡單方便，靈敏度高，回收率較高，分析時間短，適合大批量樣品的快速檢測。