大孔吸附樹脂純化紫花地丁總黃酮工藝研究

魏福榮

(江蘇吉貝爾藥業股份有限公司，江蘇 鎮江 212009)

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁ViolayedoensisMakino的干燥全草，性苦、辛、寒，歸心、肝經，具有清熱解毒，涼血消腫的功效，主要用于疔瘡腫毒，癰疽發背，丹毒，毒蛇咬傷[1]。紫花地丁含黃酮類、香豆素類、有機酸、酚類、生物堿、皂苷、多糖、氨基酸、多肽及蛋白質、植物甾醇等多種有效成分[2]。現代藥理研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗癌及抗心腦血管疾病等作用[3]。本實驗選取9種大孔樹脂，通過靜態吸附-解吸篩選出相對較優的大孔樹脂，再以總黃酮質量分數為指標，考察大孔樹脂分離純化紫花地丁總黃酮的吸附流速、上樣量和洗脫條件，優選出大孔樹脂純化紫花地丁總黃酮的條件，為紫花地丁的開發利用提供實驗依據。

1 材料與試劑

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201408)；紫花地丁(亳州市亳廣中藥飲片有限公司)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(國藥化學試劑集團有限寶恩吸附材料科技有限公司)；雙蒸水(自制)；其余試劑均為分析純。

UV2550紫外可見分光光度計(日本島津)；BAS20S(賽多利斯科學儀器有限公司)；BuchiR-200旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)；W系列微粉碎機(江陰市滿達機械設備有限公司)；HC數控超聲波清洗機(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 紫花地丁總黃酮的測定

2.1.1 對照品溶液的配制

精密稱取經120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.18 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇適量，置水浴微熱，溶解放冷并用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.2036 mg/mL的蘆丁對照品溶液，備用。

2.1.2 檢測方法[4]

分別吸取1 mL樣品置10 mL量瓶中，精密加入50 mg/mL亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，再精密吸取100 mg/mL的硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，然后加50 mg/mL NaOH 4 mL，分別加無水乙醇至刻度，搖勻，放置15 min。以空白試劑做參比，在510nm波長出測定吸光度。

2.1.3 線性關系考察

精密量取“2.1.1”項下的蘆丁對照品溶液0.8，1.2，1.6，2.0，3.0 mL，置10 mL容量瓶中，按“2.1.2 檢測方法”進行顯色，于510 nm處測定吸光度值。以吸光度值Y為縱坐標，以質量濃度X為橫坐標，繪制標準曲線，得蘆丁的回歸方法：Y=12.172X+0.0034，r=0.9996，在0.01629 mg/mL～0.06108 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 上柱液的制備[5]

將干燥的紫花地丁全草粉碎過40目篩，加入30倍量的64%乙醇，溫度為72℃用超聲波振蕩器(功率161W)振蕩32min，濾過，殘渣再重復振蕩2次，三次濾液合并，回收乙醇至無醇味，加純凈水稀釋20倍，備用。經檢測該稀釋液中總黃酮質量分數為1.93 mg/mL。

2.2 樹脂的篩選

2.2.1 樹脂的預處理

分別取9種大孔樹脂AB-8、D101、X-5、HPD400、HPD600、HPD826、NKA-Ⅱ、ADS-17、HP20，用95%乙醇浸泡一段時間，裝柱，用5%NaOH洗脫2.5BV，后用水洗脫至中性；再用5%HCl 洗脫2.5BV，用水洗脫至中性。

2.2.2 靜態吸附-解吸試驗

準確稱取經過預處理的9種大孔樹脂AB-8、D101、X-5、HPD400、HPD600、HPD826、NKA-Ⅱ、ADS-17、HP20各5g，置250 mL磨口三角瓶中，分別精密加入“2.1.4”項下制備的上柱液50 mL(黃酮質量分數為1.93 mg/mL)，25℃下至搖床中于150 r/min下振搖24 h，使之充分吸附，根據吸附前后濃度的差值，計算出平衡吸附量。取上述吸附飽和的9種大孔樹脂AB-8、D101、X-5、HPD400、HPD600、HPD826、NKA-Ⅱ、ADS-17、HP20用去離子水洗滌后，分別加入70%乙醇100 mL，25℃下至搖床中于150 r/min下振搖6 h，使之充分解吸，測定洗脫液濃度，計算出洗脫率。結果見表1。

吸附率=(吸附前總黃酮質量濃度-吸附后總黃酮質量濃度)/吸附前總黃酮質量濃度

解吸率=解吸附后總黃酮質量濃度/(吸附前總黃酮質量濃度-吸附后總黃酮質量濃度)

總黃酮回收率=吸附率×解吸率

表1 樹脂型號篩選結果Table1 Results of resin type screening

由表1結果可知，以總黃酮回收率為主要考察指標，在靜態吸附-解吸實驗中的D101型大孔樹脂總黃酮回收率高于其他樹脂，選擇D101型大孔樹脂純化紫花地丁總黃酮。

2.3 大孔吸附樹脂純化工藝優選

2.3.1 吸附流速的確定

取“2.1.4”項下制備上柱液100 mL(黃酮質量分數為1.93 mg/mL)，分別以1，1.5，2 mL/min流速通過10g已處理好的D101型大孔樹脂，進行動態吸附。流出液按照“2.1.2”項下的檢測方法測定，分別計算各自吸附量。由表2可見，隨著吸附流速加快，吸附量越小，總黃酮的泄漏愈加嚴重，故選擇吸附流速為1 mL/min為宜。

表2 不同吸附流速對吸附效果的影響Table 2 Effects of different adsorption velocity on the adsorption

2.3.2 上樣量的考察

圖1 泄露曲線Fig.1 Leakage curve

準確稱取預處理后的D101型大孔樹脂10 g，濕法裝柱，加入按“2.1.4”項下制備上柱液150 mL(黃酮質量分數為1.93 mg/mL)，上柱吸附。分段收集經吸附后的樣品液，每10 mL收集一份。選擇測定其濃度，以流出液中總黃酮濃度為縱坐標，流出體積為橫坐標，繪制動態吸附曲線，結果見圖1。由圖1可知當流出液體積達到110 mL時，黃酮開始大量泄露，即已達到飽和吸附。故飽和上樣量為110 mL。

2.3.3 洗脫溶劑的選擇

精密稱取預處理的D101大孔吸附樹脂10 g，取上柱液100 mL(黃酮質量分數為1.93 mg/mL)進行動態吸附，吸附完全后，先用100 mL水沖洗，再依次以30%，50%，70%，95%乙醇各100 mL進行梯度洗脫，每20 mL收集一份。測定每份樣品總黃酮的量，以流出體積為橫坐標，總黃酮質量濃度為縱坐標，繪制洗脫曲線。由表2可以看出，70%乙醇的轉移率更高，故選擇70%乙醇為洗脫溶劑。

2.3.4 乙醇洗脫量的確定

取經過吸附飽和的樹脂，先用一定量的去離子水洗至洗脫液顏色近無色，再以70%的乙醇洗脫，分段收集洗脫液，每10 mL一份，共10份。分別測定洗脫液中總黃酮質量濃度，以洗脫體積(BV)是樹脂的倍數為橫坐標，以洗脫率為縱坐標繪制動態洗脫曲線。由圖3可知，洗脫劑用量為8 BV時，總黃酮基本被洗脫，總黃酮洗脫率為97.56%。

圖3 洗脫量的考察Fig.3 Investigation of eluant volume

2.3.5 工藝驗證試驗

精密稱取預處理好的D101大孔樹脂10 g，3份，按照上述優選的純化條件(吸附流速 1 mL/min、上樣量110 mL、70%乙醇洗脫8BV)進行試驗，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，稱重，測定總黃酮含量，結果其中總黃酮質量分數為61.84%，62.88%，61.96%(RSD=0.91%)，表明純化工藝穩定可行。

3 討論

不同型號的大孔吸附樹脂由于其本身極性、比表面積、孔徑等不同而使自身對于同一物質的吸附能力和解吸能力有所不同，從而產生不同的吸附效果。

通過靜態吸附-解吸實驗，以總黃酮回收率為主要考察指標，發現D101型大孔樹脂的總黃酮回收率高于其他大孔吸附樹脂，故選擇D101型大孔樹脂純化紫花地丁總黃酮。在純化工藝優化中，選擇吸附流速為1 mL/min、紫花地丁總黃酮的稀釋液上樣量為110 mL(黃酮質量分數為1.93 mg/mL)和采用70%乙醇洗脫8BV的工藝條件，并通過平行的3次工藝驗證試驗，按照上述優化的純化工藝條件，經減壓濃縮、冷凍干燥后得到了紫花地丁總黃酮質量分數為61.84%，62.88%，61.96%。該大孔樹脂純化工藝簡單可行，為紫花地丁總黃酮的工業化生產提供了理論依據。