結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術在肺結核快速診斷中的應用價值

李桂杭 高東花 黃振超 羅世戰 翟翀 王輝

[摘要]目的 研究結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert MTB/RIF）在肺結核快速診斷中的應用。方法 選取2018年1～12月我院收治的132例疑似肺結核患者作為研究對象，所有疑似患者分別采用液體分枝桿菌培養管（MGIT）培養法和Xpert MTB/RIF檢測法。比較兩種檢測方法的靈敏度和特異性。結果 132例患者中，經金標準確診為肺結核的患者120例，非肺結核患者12例。液體MGIT培養法檢查確診為肺結核的患者89例，陰性43例。Xpert MTB/RIF檢測法檢查確診為肺結核的患者106例，陰性26例。Xpert MTB/RIF檢測法的靈敏度為87.50%，高于液體MGIT培養法的66.67%，差異有統計學意義（P<0.05）;Xpert MTB/RIF檢測法的特異性為91.67%，明顯高于液體MGIT培養法的25.00%，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 對于疑似肺結核的患者，可采取Xpert MTB/RIF檢測法，臨床診斷價值較高，且靈敏度和特異性較高，患者可及時治療，改善其預后，值得臨床采納。

[關鍵詞]液體分枝桿菌培養管;實時熒光定量核酸擴增檢測技術;肺結核;快速診斷

[中圖分類號] R521? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）6（c）-0149-03

[Abstract] Objective To study the application of real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection of Mycobacterium tuberculosis/Rifampicin resistance （Xpert MTB/RIF） in rapid diagnosis of tuberculosis. Methods A total of 132 suspected tuberculosis patients admitted to our hospital from January to December 2018 were selected as the research objects， all suspected tuberculosis patients were cultured by liquid mycobacterium culture tube （MGIT） and detected by Xpert MTB/RIF. The sensitivity and specificity of the two methods were compared. Results Among 132 patients， 120 were diagnosed as tuberculosis by gold standard， and 12 were non-tuberculosis. 89 cases were diagnosed as tuberculosis by liquid MGIT culture， 43 cases were negative. Xpert MTB/RIF test was performed in 106 patients with confirmed pulmonary tuberculosis and 26 patients with negative pulmonary tuberculosis. The sensitivity of Xpert MTB/RIF assay was 87.50%， higher than 66.67% of liquid MGIT culture method， the difference was significant （P<0.05）. The specificity of Xpert MTB/RIF assay was 91.67%， which was significantly higher than 25.00% of liquid MGIT culture method， the difference was significant （P<0.05）. Conclusion Xpert MTB/RIF can be used to detect suspected pulmonary tuberculosis patients. It has high clinical diagnostic value， high sensitivity and specificity. Patients can be treated in time to improve their prognosis， which is worthy of clinical adoption.

[Key words] Mycobacterial growth indicator tube; Real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection; Pulmonary tuberculosis; Rapid diagnosis

肺結核屬于慢性傳染性疾病，住院時間長，大多患者為貧困人群，采取快速可靠的方式進行診斷、實施精準治療對于控制結核病具有重要意義[1-5]。本研究旨在探討液體分枝桿菌培養管（MGIT）培養法和結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert MTB/RIF）在肺結核快速診斷中的應用價值，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2018年1～12月我院收治的132例疑似肺結核患者作為研究對象，其中，女54例，男78例;年齡16～80歲，平均（44.87±5.34）歲。納入標準：①疑似肺結核患者需要具有肺結核明顯的臨床癥狀與體征;②出現乏力、咯血、午后低熱等明顯癥狀的患者;③均知曉本研究且愿意參加者;④本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。排除標準：①影像學檢查不典型者;②病例檢查或支氣管鏡檢查為肺結核感染者;③出現心腦、肝腎等器官疾病者;④臨床資料不完善者。

1.2方法

分別在晨間、晚間、即時3個時間段取1次患者痰液，按照臨床實驗室檢驗規程，進行涂片染色與質量監控操作。3個時間段取痰所制標本，任意1次的檢出結果為陽性，記為結核分枝桿菌檢出陽性。藥敏實驗使用菌液均取自液體MGIT培養法檢出陽性者[6]。

液體MGIT培養法：本院的結核桿菌液體培養采用BD公司BACTECMGIT 960全自動分枝桿菌快速培養鑒定藥敏儀（美國JOHNSTON實驗公司）及其配套試劑（包括MGIT培養管、MGITOADC營養添加劑、PAN-TA雜菌抑制劑）。取1 ml痰標本置于50 ml有蓋的尖底離心管中，取N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉前處理液消化20 min，再次加入磷酸鹽緩沖液（PBS）到50 ml，3000 r/min離心15 min，棄上清，利用pH值為6.8的PBS液，將剩余沉淀制備成0.5 ml懸濁液，將其接種在MGIT培養管中。接種前，將MGIT培養管在無菌條件下分別加入0.8 ml MGITPANTA/OADC混合液備用。將MGIT培養管置入BACTECMGIT 960全自動快速分枝桿菌培養鑒定藥敏儀孵育培養。儀器自動判定培養結果，陰性培養管培養判讀持續6周。檢出結果為陽性的培養管，進行涂片抗酸染色以確定是否為分枝桿菌;檢出結果為陰性的培養管在仔細觀察管內渾濁情況。取0.1 ml液體MGIT培養法培養的陽性菌液，用生理鹽水稀釋100倍。取2支MGIT培養管，標為對照管與研究管，分別加入0.8 ml營養添加劑。將100 μl利福平加入觀察管中，加入0.5 ml陽性菌液;對照管加入0.5 ml∶100稀釋后的陽性菌液。置入BACTECMGIT 960全自動分枝桿菌快速培養鑒定藥敏儀內進行培養，儀器根據分枝桿菌的生長情況對比而判斷該藥物敏感性。

Xpert MTB/RIF檢測法：取1 ml痰標本置于帶蓋前處理管，加入2 ml SR痰標本處理液，將前處理管旋緊，置于螺旋振蕩器上震蕩20～30 s，取下靜置15 min，確保痰標本能夠充分液化[7]。取2 ml處理后的痰標本經過加樣孔加入Gene Xpert反應盒內，將反應盒置于Gene Xpert檢測模塊中，使用儀器自動檢測，檢測結果需要在檢測系統窗口下直接觀察。將液體MGIT培養法檢出陽性的痰標本，使用上述方法檢測MTB對利福平的耐藥情況。

1.3觀察指標及評價標準

比較兩種檢測方法的靈敏度及特異度。靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%;特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。

1.4統計學方法

采用統計學軟件SPSS 19.0分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗;計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1液體MGIT培養法檢查的診斷效能分析

132例患者中，經金標準確診為肺結核的患者120例，非肺結核患者12例。液體MGIT培養法檢查確診為肺結核的患者89例，陰性43例（表1）。

2.2 Xpert MTB/RIF檢測法檢查的診斷效能分析

132例患者中，經金標準確診為肺結核的患者120例，非肺結核患者12例。Xpert MTB/RIF檢測法檢查確診為肺結核的患者106例，陰性26例（表2）。

2.3兩種檢測方法靈敏度與特異性的比較

Xpert MTB/RIF檢測法的靈敏度為87.50%，高于液體MGIT培養法的66.67%，差異有統計學意義（P<0.05）;Xpert MTB/RIF檢測法的特異性為91.67%，明顯高于液體MGIT培養法的25.00%，差異有統計學意義（P<0.05）（表3）。

3討論

隨著我國人口流動處于較為頻繁的狀態，且我國外來肺結核患者的流動性較大，耐藥結核病、結核菌/艾滋病病毒雙重感染、流動人口結核病防治屬于今后結核病防治工作的三大挑戰，應根據實際逐步開展結核菌培養與藥物敏感性實驗，確保患者能得到及時的診斷[8-12]。

本研究結果顯示，132例患者中，經金標準確診為肺結核的患者120例，非肺結核患者12例。液體MGIT培養法檢查確診為肺結核的患者89例，陰性43例。Xpert MTB/RIF檢測法檢查確診為肺結核的患者106例，陰性26例。Xpert MTB/RIF檢測法的靈敏度為87.50%，高于液體MGIT培養法的66.67%，差異有統計學意義（P<0.05）;Xpert MTB/RIF檢測法的特異性為91.67%，明顯高于液體MGIT培養法的25.00%，差異有統計學意義（P<0.05）。Xpert MTB/RIF檢測技術是將樣品準確、定量PCR擴增與熒光檢測結合的檢測分析系統，操作較為簡單，且無需培訓，僅需要在標本盒中加入待檢測標本，系統即可自動完成標本純化，24 h內可獲得檢測結果[13-14]。檢測期間封閉性較好，不會出現交叉感染，對涂陰肺結核患者敏感度較高，目前該項技術已經被世界衛生組織納為結核病推薦的檢驗方法[15]。而MGIT培養法檢測原理主要為底部包埋的熒光物質，能夠對培養管中的氧含量變化產生一定的反應，結核分枝桿菌在MGIT內生長會消耗管內氧，受到特定光源激發后，熒光物質會釋放出熒光，并采取讀數儀進行判定;整個操作較為復雜，耗時較長。且Xpert MTB/RIF能夠多通道設計，可同時檢測多個標本，檢測時間明顯縮短，臨床較為高效，并提供利福平耐藥基因突變信息，為肺結核的快速診斷提供了重要參考。

綜上所述，對于疑似肺結核的患者，可采取Xpert MTB/RIF進行檢測，診斷價值較高，能確保患者及時進行治療，改善其預后，值得應用。由于本研究樣本數量有限，研究項目較少，結果可能會出現一定的偏差，臨床后期可加大樣本容量，增加研究項目，完善實驗結果。

[參考文獻]

[1]牛家峰，尚永明，張寧，等.復治肺結核患者痰液耐藥結核分枝桿菌鑒定中熒光定量PCR與反向點雜交技術的聯合應用[J].山東醫藥，2016，56（31）：69-71.

[2]殷雨天，張靚，張越，等.結核分枝桿菌痰培養陽性肺結核患者對一線抗結核藥耐多藥情況分析[J].吉林大學學報（醫學版），2015，41（5）：1080-1084.

[3]王新寧，施旭東，劉根焰，等.酶聯免疫斑點技術和分枝桿菌改良羅氏固體培養法在肺結核輔助診斷中的價值[J].臨床檢驗雜志，2015，33（12）：898-899.

[4]申秀麗，王兆芬，李斌，等.青海地區結核分枝桿菌鏈霉素耐藥基因rpsL和gidB突變特征[J].國際藥學研究雜志，2018，45（3）：205-210.

[5]李曉非，黃山，歐陽兵，等.利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術在肺結核臨床路徑中的應用[J].山東大學學報（醫學版），2018，56（6）：35-40.

[6]胥江俊，胡屹，蔣偉利，等.上海市流動人口肺結核患者密切接觸者結核分枝桿菌潛伏感染情況及危險因素[J].中華結核和呼吸雜志，2016，39（1）：25-29.

[7]林日文，李靜.利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術檢測333例肺結核患者痰標本的結果分析[J].國際檢驗醫學雜志，2016，37（20）：2901-2902.

[8]卜嵐，白軒.HIV/AIDS合并肺結核患者抗結核分枝桿菌治療肝毒性的危險因素[J].中華實驗和臨床感染病雜志（電子版），2018，12（2）：183-188.

[9]李玉雪，王薇，柳曉金，等.恒溫擴增檢測結核分枝桿菌特異性IS6110片段在肺結核檢測中的應用[J].標記免疫分析與臨床，2017，24（11）：1310-1312.

[10]張瀝元，黃芙靜，許峻旗，等.結核分枝桿菌酸抗性基因及其調控網絡[J].遺傳，2018，40（7）：552-566.

[11]耿新峰.痰液涂片試驗和結核分枝桿菌培養應用于肺結核患者早期診斷、鑒別診斷和治療中的臨床研究[J].中國血液流變學雜志，2017，27（1）：101-102.

[12]唐潔，陳策，查成，等.肺結核患者外周血中結核分枝桿菌耐熱抗原特異性的TNF-α+γδT細胞數量和亞群分析[J].細胞與分子免疫學雜志，2016，32（11）：1527-1531.

[13]龔清，楊華鋒，付紅繼.左氧氟沙星與抗結核藥聯合治療結核分枝桿菌陽性復治肺結核的可行性研究[J].中國醫院用藥評價與分析，2017，17（2）：192-193，196.

[14]趙冰，侯萍，黃靜，等.高敏感度酶聯免疫吸附測定法檢測分泌蛋白MPB64對于活動性肺結核診斷的價值[J].中國防癆雜志，2017，39（12）：1303-1308.

[15]王少華，鄭丹薇，朱巖坤，等.兩種恒溫擴增分子檢測法與實時熒光定量核酸擴增法對肺結核診斷價值的比較[J].中華結核和呼吸雜志，2018，41（2）：105-110.

（收稿日期：2019-03-08? 本文編輯：劉克明）