采用全自動(dòng)在線固相萃取-高效液相色譜法檢測畜禽產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留量

程傳民，達(dá)列亞，李 云，柏 凡，魏 敏，王宇萍，李 茂，樊淑娜

（1.四川省飼料工作總站，四川成都610041；2.新疆維吾爾族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊833000）

氟喹諾酮屬于促旋酶抑制劑四個(gè)亞型中的一種，一般將氟喹諾酮稱為二代喹諾酮。其常作為獸用藥物，被廣泛應(yīng)用于食用動(dòng)物。氟喹諾酮是廣譜抗生素，對多種細(xì)菌有抑制作用，特別是針對牛、豬和雞。由于此類藥物的大量使用，致使動(dòng)物產(chǎn)生抗藥反應(yīng)，歐盟委員會(huì)制定的法令（EEC）No 2377/90，規(guī)定了一些氟喹諾酮類藥物的最大殘留限量（MRLs）。因此建立一種多組分、經(jīng)濟(jì)、方便、靈敏度高的全自動(dòng)在線固相萃取-高效液相色譜檢測方法很有必要。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 在線固相萃取-高效液相色譜儀（美國Aglient 1260）；電子天平（0.01 mg，德國賽多利斯公司）；渦旋振蕩器（禾本森科有限公司）；電動(dòng)振蕩器（美國IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)（Biofug PrimoR公司）。

1.1.2 材料 乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）；乙酸（色譜純，F(xiàn)luka）；0.1%三氟乙酸（用三乙胺調(diào)pH=3.0）（色譜純，CNW）；氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品（DR公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品的配制：分別稱取0.01 g（精確至0.1 mg）標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為1 mg/mL。將各標(biāo)準(zhǔn)儲備液用20%乙腈溶液稀釋，配成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，各組分濃度為10 mg/L，用20%乙腈溶液配制成目標(biāo)藥物濃度為1、2、5、10、50、100μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2 樣品處理 稱取均質(zhì)畜禽產(chǎn)品樣品2.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入5 mL 1%乙酸乙腈（肉類加1 mL水，混勻后加4 mL 1%乙酸乙腈），渦旋提取2 min，在溫度為4℃的條件下，10000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一50 mL離心管中，重復(fù)提取一次。離心后合并上清液，加入20 mL正己烷，渦旋混合1 min，在溫度為4℃的條件下，10000 r/min離心2 min，移去正己烷，取1 mL乙腈層到10 mL離心管中，加入4 mL水，過0.22μm濾膜后上機(jī)測定。

1.3 色譜條件 色譜柱：Aglient Eclipse XDBC18，規(guī)格150 mm×4.6 mm，粒徑5μm，富集柱：C18的預(yù)柱。分析泵流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積100μL；柱溫為30℃。檢測波長：激發(fā)波長280 nm；發(fā)射波長450 nm。分析泵流動(dòng)相：A為0.1%三氟乙酸溶液（pH=3.0），B為乙腈溶液，流動(dòng)相比例為A+B=88+12。運(yùn)行時(shí)間35 min。上樣泵流動(dòng)相采用甲醇-水的二元溶液。采用溶劑梯度和流速梯度相結(jié)合的方式，具體見表1。閥切換：0～1 min：閥處于位置1，分析泵直接與分析柱聯(lián)通，平衡色譜柱，上樣泵將待處理的樣品從自動(dòng)進(jìn)樣器推到富集柱上進(jìn)行富集和凈化；1～2 min：閥處于位置2，分析泵與富集柱聯(lián)通，將富集在柱頭的待測樣品反著沖到分析柱上進(jìn)行分離分析，富集泵直接排廢液；2 min以后：閥處于位置1，分析泵繼續(xù)完成分離分析，富集泵與富集柱相連，沖洗并平衡富集柱，以備下一次上樣。

表1 上樣泵液相色譜梯度洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)研究了甲醇-乙腈-0.1%三氟乙酸和乙腈-0.1%三氟乙酸兩種流動(dòng)相對6種氟喹諾酮類藥物分離度的影響，以甲醇-乙腈-0.1%三氟乙酸（5+8+87）為流動(dòng)相時(shí)可以實(shí)現(xiàn)氟喹諾酮的基線分離，同時(shí)也可以多檢測2種氟喹諾酮藥物，增加的藥物為氧氟沙星和沙拉沙星，當(dāng)需要檢測這兩種氟喹諾酮時(shí)可采用此條件，但運(yùn)行時(shí)間相當(dāng)長，見圖1a。以乙腈-0.1%三氟乙酸（12+88）為流動(dòng)相時(shí)可以實(shí)現(xiàn)6種氟喹諾酮藥物的分離，但諾氟沙星和氧氟沙星是完全沒有分開的，由于氧氟沙星靈敏度相對較低，本研究選擇做諾氟沙星，在樣品檢測時(shí)應(yīng)注意藥物的定性，色譜分離情況見圖1b。

2.2 色譜柱的選擇 本研究比較了Agilent poroshell 120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7μm、Agilent SB-C18 2.1 mm×100 mm，1.8μm和Aglient Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5μm色 譜柱，使用標(biāo)準(zhǔn)工作液對各規(guī)格色譜柱性能進(jìn)行考察。Agilent poroshell 120在流速為0.4 mL/min的情況下，各目標(biāo)化合物可以達(dá)到基線分離，但運(yùn)行時(shí)間要到50 min。Agilent SB-C18在流速為0.3 mL/min的情況下，各目標(biāo)化合物分離度不是很理想，色譜峰的對稱性也相對差一點(diǎn)，可能和本實(shí)驗(yàn)使用的色譜柱的柱效有較大關(guān)系。若使用上述兩種色譜柱還需進(jìn)一步改變色譜條件。Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱峰型和分離度可以滿足本研究方法的要求，且一般實(shí)驗(yàn)室比較常見。

2.3 線性關(guān)系和檢出限 將6種氟喹諾酮藥物分別配制成質(zhì)量濃度為1～100μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用本實(shí)驗(yàn)條件對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以濃度X對所測物質(zhì)的峰面積Y作圖，得到線性方程以及線性相關(guān)系數(shù)。以實(shí)際可以檢測出最低添加量為檢出限。各目標(biāo)化合物線性方程和檢出限見表2。

2.4 樣品測定 本實(shí)驗(yàn)對2個(gè)雞蛋和2個(gè)雞肉陽性樣品進(jìn)行檢測，此檢測結(jié)果與應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法—雞蛋和雞肉中氟喹諾酮類藥物及金剛烷胺殘留測定操作細(xì)則（2018年全國例行檢測使用的液質(zhì)內(nèi)標(biāo)定量方法）的檢測結(jié)果相對偏差小于8.0%，各目標(biāo)化合物無雜質(zhì)峰干擾，凈化效果好，樣品色譜圖見圖2。由此可見本實(shí)驗(yàn)方法與標(biāo)準(zhǔn)方法有較好的吻合，具體檢測結(jié)果見表3。

圖1 氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

表2 6種氟喹諾酮藥物的線性關(guān)系和檢出限

圖2 陽性樣品色譜圖（a：雞肉,b：雞蛋）

表3 陽性樣品檢測結(jié)果與使用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果對照

2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 在3種不同類型空白試樣中分別添加低水平和高水平2種劑量的氟喹諾酮藥物。按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。樣品加標(biāo)回收率（AR）為81.9%～106.8%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.52%。該方法的回收率和重現(xiàn)性均較好。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)檢測6種氟喹諾酮藥物的全自動(dòng)在線固相萃取-高效液相色譜法，無干擾雜質(zhì)峰，凈化效果較好。6種氟喹諾酮藥物在35 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離，其線性相關(guān)系數(shù)大于0.9980，6種氟喹諾酮平均回收率為81.9%～106.8%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.52%；定量限為2.5μg/kg。該方法操作簡單、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。