超高效液相色譜串聯質譜法同時測定香辛料中7種真菌毒素

黃思瑜,董憲兵,周純潔,鄧宇杰,李 紅,楊小珊

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院,重慶 401121)

真菌毒素是一類由真菌產生的具有毒性的二次代謝產物,能夠廣泛污染農作物及食品[1],比較常見的真菌毒素有:黃曲霉毒素(aflatoxin,AF)、赭曲霉毒素(ochratoxin,OT)、伏馬菌毒素(fumonisin,FB)等。研究表明,真菌毒素可以引起人類的急性或慢性中毒,許多真菌毒素的毒性是多器官性的。根據聯合國糧食及農業組織(FAO)估計全球每年約有25%的農作物遭受真菌及其毒素污染,全球每年因真菌毒素污染而造成的直接及間接損失將達到數百億美元[2]。

我國是香辛料的主要生產國和出口國之一,主要的品種有辣椒、花椒和八角等[3]。香辛料是一種很容易受到霉菌及其產生的真菌毒素污染的植物性農產品。在香辛料加工、貯藏、運輸和銷售過程中都容易受到霉菌的侵染,污染香辛料的霉菌在適宜的條件下可以產生真菌毒素,主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌毒素等,這些真菌毒素的存在會對消費者健康產生潛在的危害[4]。香辛料中真菌毒素的檢測目前主要有高效液相色譜法、高效液相色譜串聯質譜/質譜法和酶聯免疫吸附測定法,但以上僅針對香辛料中單一真菌毒素的檢測。隨著各種高精尖儀器的成功應用,快速篩查技術、高通量的檢測技術,即專屬、高效、經濟的前處理手段,多成分同時分析的檢測手段以及成功避免假陽性的技術已成為未來檢測多真菌毒素技術的發展趨勢[5-6]。王玉嬌等[7]建立了超高效液相色譜—串聯質譜法同時檢測干果中16種真菌毒素,楊萬穎等[8]建立了液相色譜串聯質譜法同時測定小麥粉中10種真菌毒素,葛寶坤等[9]用免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯質譜法測定中藥材中的14種真菌毒素。此外,關于植物油、糧谷飼料、桑葚等基質中多真菌毒素的檢測也有相關研究[10-15]。但是基質相對復雜的香辛料中多真菌毒素的高通量檢測方法還沒有相關的報道。

本文選用香辛料中常用的辣椒、花椒和八角作為研究基質,通過優化質譜條件,對比不同真菌毒素提取溶劑的提取效果,不同定容溶液的定容效果,建立了香辛料中7種真菌毒素同時測定的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青花椒、重慶石柱辣椒、廣西八角 重慶盤溪糧油批發市場;黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準溶液 美國Supelco公司;赭曲霉毒素A標準溶夜 糧食局科學研究院;伏馬菌毒素B1、B2標準溶液 Romer國際貿易(北京)有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,德國Merck公司;磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉 分析純,成都市科龍化工試劑廠;甲酸 色譜純,德國CNW公司。

ACQUITYTM型超高效液相色譜、HSS T3型液相色譜柱 美國Waters公司;API4000型液質聯用儀 美國AB SCIEX公司;Allegra X-30型高速離心機 美國貝克曼庫爾特公司;Milli-Q型全自動超純水機 美國Millipore公司;SB25-120TN型超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;FW200型粉碎機 江蘇金壇市友聯儀器研究所;Myco6in1TM多真菌毒素免疫親和凈化柱 美國Vicam公司;電子天平SQP 德國Sartorius公司;Vortex3渦旋混勻器 德國IKA儀器有限公司;MD200-2型氮吹儀 杭州奧盛儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 混合標準溶液的配制 各取適量上述真菌毒素標準溶液用甲醇配成濃度分別為黃曲霉毒素B1(AFB1)50 μg/L、黃曲霉毒素B2(AFB2)100 μg/L、黃曲霉毒素G1(AFG1)100 μg/L、黃曲霉毒素G2100 μg/L(AFG2)、赭曲霉毒素A(OTA)100 μg/L、伏馬菌毒素B1(FB1)2000 μg/L、伏馬菌毒素B2(FB2)2000 μg/L的混合標準使用溶液,用于添加回收實驗和制備標準系列溶液,4 ℃條件下避光保存。

1.2.2 樣品前處理 分別把青花椒、重慶石柱辣椒、廣西八角三種樣品用粉碎機粉碎,稱取5 g(精確至0.01 g)粉碎后樣品于50 mL離心管中,加入12 mL水,渦旋振蕩15 min,再加入28 mL甲醇(甲醇∶水=7∶3,V/V),繼續渦旋振蕩15 min,8000 r/min離心10 min,玻璃纖維濾紙過濾,收集濾液于干凈的容器中,準確移取5 mL濾液,在40 ℃條件下氮吹至2 mL,在濃縮液中加入5 mL PBS(pH7.4±0.1)緩沖液[16],渦旋混勻,待凈化。

將上述7 mL稀釋液緩慢通過Myco6in1TM真菌毒素免疫親和凈化柱,直至空氣進入凈化住,將10 mL PBS(pH7.4±0.1)溶液以1滴/s的流速通過親和柱,直至空氣進入親和柱。將2 mL甲醇加入到親和柱中,使親和柱凝膠部分完全浸泡在甲醇中,且不流出,并將親和柱底部用原帽堵住,靜置5 min。然后以兩秒1滴的流速淋洗親和柱,將淋洗液收集于玻璃試管中。再加入2 mL純水過親和柱,以兩秒1滴的流速淋洗親和柱,將淋洗液收集于同一玻璃試管中。取2 ml洗脫液在40 ℃氮吹至近干,準確加入1 mL甲醇-水(50∶50,v/v)定容,混勻,0.22 μm濾膜過濾,供液相色譜-串聯質譜測定。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:HSS T3(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相:0.1%甲酸水溶液(A),0.1%甲酸乙腈溶液(B),梯度洗脫:0～0.5 min,5% B;0.5～1.5 min,5%～60% B;1.5～3.5 min,60%～95% B;3.5～4 min,95%～60% B;4～5 min,60%～5% B。流速:0.4 mL/min;進樣體積:5 μL。

1.2.4 質譜條件 離子化模式:電噴霧電離正離子模式(ESI+);質譜掃描方式:多反應監測(MRM);電噴霧電壓(IS):4500 V;離子源溫度(TEM):5500 ℃;氣簾氣壓力(CUR):30 psi;霧化氣壓力(GSI):40 psi;輔助氣壓力(GS2):50 psi;碰撞氣壓力(CAD):5 psi;各真菌毒素質譜參數詳見結果與分析中的表1。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

分別將7種真菌毒素化合物的標準溶液配制成濃度為0.5 μg/mL的標準溶液,以10 μL/min的流速注入質譜中。在全掃描模式下對標準物質先進行一級質譜分析(Q1掃描),得到分子離子峰,選取相應的母離子峰,對其子離子進行二級質譜分析(Q2掃描),得到碎片離子信息,然后對得到的質譜參數進行優化。得到每種真菌毒素合適的離子模式、母離子、子離子及相對應的碰撞能量、去簇電壓。各個真菌毒素的母離子、子離子及對應的質譜參數見表1。

表1 真菌毒素的質譜參數Table 1 MS/MS condltlons for mycotoxins

2.2 提取條件的優化

乙腈和甲醇是近年來生物毒素分析中最常用的2種萃取溶劑。在優化提取實驗過程中,以回收率實驗比較,選用最佳提取溶劑。參考鄭榮等[17]、孫娟等[18]的方法,選用50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、50%乙腈、70%乙腈、90%乙腈作為提取溶劑,分別考察各個提取液回收率。根據圖1可知,不同濃度和不同試劑的提取液對真菌毒素提取效率有一定影響,隨著有機試劑濃度增加,提取回收率逐漸升高,但是有機試劑濃度過高時,回收率反而會降低。可能是當甲醇、乙腈濃度增加時,會適當增加真菌毒素的萃取回收率,但是隨著濃度的增大會降低多功能凈化柱的凈化中分析物在凈化柱的保留效果,反而會降低真菌毒素的回收率[18]。70%甲醇溶液和70%乙腈溶液提取效率差別不大,綜合考慮經濟成本選用70%甲醇溶液作為提取試劑。實驗發現,先用水提取后再按比例加入甲醇提取的回收率高于直接用70%甲醇。本實驗最終選用先加12 mL水提取后再加入28 mL甲醇提取。

圖1 提取液濃度對7種真菌毒素提取效果的影響Fig.1 Effect on recovery rate of 7 mycotoxins under different concentrations of extractant

2.3 定容溶液的選擇

本實驗選用20%甲醇、50%甲醇和80%甲醇作為定容溶液。結果顯示,當選用50%甲醇定容時目標峰面積高于選用20%甲醇和80%甲醇定容的峰面積,有可能是當定容溶液中水的比例過高時,目標物不溶,有機試劑比例較高時,可能導致部分目標物在水相比例較大時在色譜柱中析出[20]。故本實驗最終選用50%甲醇定容上機測定。

2.4 方法的定量限

取空白樣品,按照1.2.3方法處理后添加真菌毒素混合標準溶液,進行檢測。以信噪比(S/N)為10計算得出本方法定量限(LOQ)為AFB1為0.5 μg/kg,AFB2、AFG1、AFG2為1.0 μg/kg,OTA為1.0 μg/kg,FB1、FB2為20 μg/kg。7種真菌毒素在測定方法定量限時的標準溶液色譜圖見圖2。

圖2 真菌毒素標準溶液的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of mycotoxin standard solutions注:左邊為該化合物定量離子色譜圖,右邊為定性離子色譜圖。

2.5 方法的線性范圍

在本方法所確定的實驗條件下,用甲醇-水溶液(50∶50,v/v)配制系列濃度的真菌毒素標準溶液并分別進行測定,以峰面積(Y)對相應真菌毒素的濃度(X)繪制標準曲線(表2),結果表明AFB1濃度在線性范圍為0.5～10 μg/kg,AFB2、AFG1、AFG2、OTA濃度在線性范圍為1～20 μg/kg,FB1和FB2濃度在線性范圍為20～400 μg/kg時與其峰面積呈良好線性關系,相關系數(r)在0.995以上。

表2 各種真菌毒素的線性關系Table 2 Linear relationships of 7 mycotoxins

2.6 方法的回收率和精密度

采用不含以上7種真菌毒素的辣椒、花椒、八角為空白樣品基質,進行3個水平的添加回收實驗,3個添加量分別為1倍、2倍和10倍的各真菌毒素的測定方法定量限,每個濃度水平進行6次重復實驗,分析并測定其精密度及回收率(表3),3個加標水平下平均回收率為67.25%～113.47%,相對標準偏差為1.07%～10.20%,符合痕量分析的要求,詳見表3。

表3 方法的加標回收率和精密度(n=6,%)Table 3 Results of recovery and precision tests(n=6,%)

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜同時測定香辛料中7種真菌毒素的方法。粉碎后的樣品先用水提取后按比例加入甲醇提取(甲醇-水,70∶30,v/v),多功能免疫親和柱凈化后濃縮,50%甲醇定容,用超高效液相色譜-串聯質譜進行分析。結果表明:該方法前處理簡單、凈化效果好、靈敏度高和高通量檢測,適用于香辛料中7種真菌毒素殘留的分離和檢測。該方法填補了香辛料中多真菌毒素高通量檢測的空白,能為香辛料中真菌毒素風險監測提供技術支持。