不同芽孢桿菌對極早熟桃采后鏈格孢菌的防治效果及其發酵液揮發性物質成分分析

鄭香香,張 娜,閻瑞香,陳存坤,關文強,*

(1.天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134;2.國家農產品保鮮工程技術研究中心(天津),天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室,天津 300384;3.天津科技大學包裝與印刷工程學院,天津 300222)

桃(AmygdaluspersicaLinn.)屬薔薇科(Rosaceae)桃屬植物,其果實風味濃郁,肉質鮮美多汁,且富含蛋白質、維生素、糖類、胡蘿卜素及微量元素等多種營養物質[1]。我國桃的種植品種眾多,但多數均為中晚熟品種,適于種植的優質早熟桃品種較少[2-3]。“津柳早紅”是由天津學香果蔬有限公司和天津農學院互助培育而成的一個極早熟桃品種,其果實著色早,6月上旬即為成熟期,果肉呈乳白色,肉質細膩,纖維少,汁液豐富,風味酸甜適口[2]。桃屬于呼吸躍變型果實,采后在常溫下易快速成熟軟化,且在運輸和貯藏過程中極易受微生物侵染而造成腐爛變質,失去商品價值[4]。鏈格孢菌(Alternariaalternata)是桃采后主要致病菌之一,被其侵染的果實表面出現褐色斑點,斑塊上長出墨綠色或黑色霉狀物,并生出灰白色菌絲[5],后期果實在貯藏或運輸過程中由于溫度波動或機械傷等原因會出現大面積腐爛,造成嚴重的經濟損失。

目前桃的采后病害防治措施主要為低溫貯藏與化學保鮮劑相結合的方式[6],但長期使用化學保鮮劑會帶來的安全性、環保性和抗藥性等問題。生物防治作為果蔬采后病害防治的新方法,因其安全、綠色、環保、無抗藥性等特點而逐漸成為國內外果蔬保鮮的研究熱點[7]。芽孢桿菌(Bacillus)是一類好氧、內生芽孢的革蘭氏陽性細菌,在自然界中廣泛存在,且營養簡單、生長快,其芽孢能忍受極端的外部環境而長期存活,有利于生防菌劑的生產,是一種理想的生防微生物[8-10]。大量研究表明芽孢桿菌能有效抑制果蔬采后病害,對蘋果[11]、柑橘[12]、梨[13]、水蜜桃[14]、黃瓜[15]等果蔬的抑菌防治都有研究報道。微生物在生長過程中會產生一系列揮發性物質(Volatile organic compounds,VOCs),而這些物質作為生防因子能有效抑制許多病原菌的生長[16-18]。例如Fernando等[19]最先報道了假單孢屬(Pseudomonas)的14種細菌揮發性物質可以抑制真菌菌絲的生長和孢子的萌發;陳奕鵬等[20]研究芽孢桿菌BEB17產生的揮發性有機物可抑制多種病原真菌生長,其中對香蕉枯萎病菌抑制效果最強。但目前關于芽孢桿菌的揮發性物質對桃的主要致病菌鏈格孢菌的抑制作用,以及芽孢桿菌對極早熟桃采后保鮮效果的研究還鮮見報道。

本研究以“津柳早紅”極早熟桃為研究對象,初步探究三種芽孢桿菌HB-2、B1和X對桃采后鏈格孢病菌的抑制作用以及對極早熟桃采后保鮮效果的影響,并對其發酵液中揮發性物質的抑菌活性和主要成分進行分析,以期為早熟桃采后的病害防治和保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桃果實“津柳早紅” 采摘于天津市西青區大柳灘桃園,采收八成熟(極早熟)健康果實于當天運回實驗室預冷并貯藏于0 ℃冷庫中;鏈格孢菌(Alternariaalternata) 由本實驗室從自然發病的桃上分離所得,并進行純化培養及DNA鑒定;芽孢桿菌HB-2(Bacillusamyloliquefaciens) 天津市植物保護研究所提供;芽孢桿菌B1(Bacillusamyloliquefaciens)和X(Bacillussubtilis) 本實驗室保存菌種;可溶性淀粉、氫氧化鈉 化學純,天津市科密歐化學試劑有限公司;草酸 化學純,天津市光復科技發展有限公司;碘、抗壞血酸 化學純,天津市贏達稀貴化學試劑廠;馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、Luria-Bertani培養基 北京陸橋技術股份有限公司。

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;LS-50HJ立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫療設備有限公司;HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養箱 上海-恒科學儀器有限公司;HWS-250BX恒溫恒濕箱 天津市泰斯特儀器有限公司;METTLER TOLEDO EL2044電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;PAL-1型手持糖量計 日本ATAGO(愛拓)公司;TA-XT.plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司;TRACE DSQ氣質聯用儀 美國Thermo Finnigan公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS灰色萃取頭 美國Supelce公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌發酵液的制備 將三種芽孢桿菌菌種接種于LB培養基中,于28 ℃ 200 r/min條件下恒溫振蕩培養48 h,得到發酵液。將新鮮活化48 h的芽孢桿菌菌株HB-2、B1、X發酵液用無菌生理鹽水調至菌體濃度為1×107cfu/mL待用。

1.2.2 不同芽孢桿菌發酵液對鏈格孢菌的活體抑制作用 將健康、無病害、大小一致的桃果實用清水沖洗干凈,并用75%的乙醇進行表面消毒,晾干。用無菌針在果實赤道兩邊果面分別刺3 mm×3 mm的傷口,然后分別滴加20 μL活化48 h的三種芽孢桿菌發酵液HB-2、B1和X(1×107cfu/mL),對照組CK滴加無菌水,待其完全滲透果實傷口處后,用打孔器(d=6 mm)將PDA培養基上培養7 d的鏈格孢菌打成直徑6 mm的菌餅,并將鏈格孢菌菌餅反接在傷口處[4]。每個處理組5個果實,試驗重復3次。將處理后的果實置20 ℃條件下貯藏7 d,并定期觀察測量病原菌病斑擴展直徑,計算其病斑擴展抑制率。病斑擴展抑制率(%)=(對照病斑擴展直徑-處理病斑擴展直徑)×100/對照病斑擴展直徑。

1.2.3 不同芽孢桿菌發酵液對極早熟桃采后的保鮮效果

1.2.3.1 樣品處理 挑選采摘后的大小均勻、無病蟲害、無機械損傷的桃果實,分別用不同的芽孢桿菌處理液浸泡3 min,晾干后放入塑料筐,并用PE袋(d=0.02 mm)套在塑料筐外面扎口,保持一定的濕度,置于0 ℃冷庫內貯藏70 d。試驗共設4個處理:處理1:芽孢桿菌HB-2發酵液浸泡;處理2:芽孢桿菌B1發酵液浸泡;處理3:芽孢桿菌X發酵液浸泡;對照CK:無菌水浸泡。每個處理3個重復,每個重復25個果實,每隔14 d對各處理每個重復的果實進行品質指標測定。

1.2.3.2 品質指標的測定及方法 腐爛率的測定:按照果實腐爛面積大于25%時即為腐爛的標準,由公式計算腐爛率:腐爛率(%)=(腐爛果實個數/果實總個數)×100;維生素C含量的測定:采用碘量法[21]進行測定;可溶性固形物含量的測定:將桃果肉勻漿用四層紗布擠壓取汁,然后用PAL-1型手持糖度計進行測定,每一個樣品重復測定三次,取平均值;可滴定酸含量的測定:采用張娜等[4]方法稍作修改測定;硬度的測定[4]:采用質構儀進行測定,采用P/2探頭對桃果實縫合線兩側果面帶皮穿刺,探頭直徑為2 mm,探頭下壓距離為10 mm,測試速度為2 mm/s。

1.2.4 不同芽孢桿菌處理液對鏈格孢菌抑菌活性的測定 將病原菌菌餅反接在PDA平板中間,采用十字劃線法[22]在距離菌餅2.5 cm處放置直徑6 mm的無菌濾紙片,每只平板等距離貼4片,并在濾紙片上分別滴加15 μL處理液發酵液:芽孢桿菌培養原液;濾液:芽孢桿菌發酵液在10000 r/min下,4 ℃離心10 min,用0.20 μm濾膜將上清液過濾所得液體;滅活菌液:將芽孢桿菌發酵菌液裝入塑料炮彈管,在沸水浴中加熱煮沸15 min,冷卻后即得到滅活菌液;無菌水:作為對照。試驗重復3次,將平板在28 ℃條件下倒置培養5 d,定期觀察病原菌菌落的變化,測量病原菌菌落直徑,計算其病斑擴展抑制率。

1.2.5 不同芽孢桿菌揮發性氣體的抑菌活性測定 采用平板倒扣法[23]測定。在PDA平板中央接種培養5～7 d的供試病原菌菌餅(d=6 mm),取1.2.1中活化培養的芽孢桿菌發酵液100 μL涂布在LB平板上,并將其倒扣在病原菌培養平板上,用封口膜密封,置28 ℃恒溫培養箱培養5 d,以不接芽孢桿菌的空白LB平板作對照。采用十字劃線法測量病原菌病斑擴展直徑,計算其病斑擴展抑制率。

1.2.6 不同芽孢桿菌揮發性物質的GC-MS鑒定 取1.2.1中培養的芽孢桿菌發酵液200 μL,轉接于頂空瓶中的LB固體培養基上,28 ℃培養48 h。將萃取頭插入頂空瓶中40 ℃頂空吸附揮發性物質40 min后,立即插入GC-MS進樣口,在240 ℃下解吸附5 min后,進行GC-MS分析。

色譜條件:采用DB-5毛細管色譜柱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣:He,程序升溫:40 ℃保持2 min,以10 ℃/min升溫到120 ℃,以6 ℃/min升溫至180 ℃,以10 ℃/min升溫至230 ℃,保持5 min。進樣口溫度240 ℃,采用不分流,載氣He,流量1.0 mL/min,萃取頭在進樣口脫附5 min。

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源,檢測器電壓350 V,離子源溫度200 ℃,傳輸線溫度250 ℃,電子能量70 eV,掃描質量范圍35～650 m/z[24]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同芽孢桿菌發酵液對鏈格孢菌的活體抑制作用

由表1可知,將病原菌菌餅接種于果實表面傷口處,20 ℃貯藏7 d后,對照組CK發病率100%,采用三種芽孢桿菌發酵液處理后均能有效抑制桃采后病原菌鏈格孢菌病斑的擴展,且HB-2、B1、X對桃果實病原菌病斑擴展的抑制率分別為52.53%、40.32%和47.99%。由顯著性差異分析可知,三種芽孢桿菌發酵液對鏈格孢菌病斑的抑制作用顯著且效果為HB-2>X>B1(p<0.05)。

表1 不同芽孢桿菌發酵液對鏈格孢菌的活體抑制作用Table 1 Inhibition of different Bacillus fermentation broths against Alternaria in vivo

2.2 不同芽孢桿菌發酵液對極早熟桃采后的保鮮效果

通過活體預防試驗可知,三種芽孢桿菌發酵液都對鏈格孢菌有明顯抑制作用。但水果在貯藏過程中受多種因素影響,其生理生化變化復雜,為進一步探究不同芽孢桿菌對極早熟桃采后腐爛率和品質的影響,采用不同芽孢桿菌發酵液對桃果實進行浸泡處理。如表2所示,0 ℃貯藏70 d后,三種芽孢桿菌處理的桃果實腐爛率均顯著低于對照組CK(p<0.05)。對照組的果實大部分發生霉變腐爛,而芽孢桿菌處理過的果實其腐爛程度明顯降低,其中HB-2貯藏效果最好,X和B1次之。對照組腐爛率為78.70%,而HB-2處理的果實腐爛率僅為22.70%,腐爛率降低了56.00%。

表2 不同芽孢桿菌發酵液對極早熟桃采后的保鮮效果Table 2 Fresh-keeping effect of different Bacillus fermentation broth on post-harvest peach

隨著貯藏時間的延長,果實中的VC含量、可溶性固形物含量和可滴定酸含量均會發生下降。在貯藏結束后,芽孢桿菌處理的桃果實其VC含量和可滴定酸含量均顯著高于對照組(p<0.05)。與對照組相比,芽孢桿菌B1和X處理的桃果實其可溶性固形物含量無明顯差異,HB-2處理的果實其可溶性固形物含量則顯著高于對照組(p<0.05),說明三種芽孢桿菌均能有效延緩桃的VC和可滴定酸含量的下降,且HB-2能較好地維持可溶性固形物的含量。硬度也是衡量果實品質的重要指標之一。由表2可知,對照組CK的果實硬度僅為11.25 kg/cm2,而三種芽孢桿菌處理的桃果實其硬度均顯著高于對照組(p<0.05),說明三種芽孢桿菌能有效維持果實的硬度。

2.3 不同芽孢桿菌處理液對鏈格孢菌的體外抑菌活性

由活體預防試驗和浸泡試驗結果可知,三種芽孢桿菌對桃采后致病菌鏈格孢菌均有明顯抑制作用且能夠延緩果實的貯藏期品質的降低,為進一步探究其抑菌作用機理,通過平板對峙試驗測定芽孢桿菌不同處理液對病原菌的抑制活性。試驗中三種芽孢桿菌滴加無菌水的濾紙片對病原菌無抑制作用,菌絲迅速生長,而由圖1可知,芽孢桿菌的不同處理液對病原菌的抑制作用不同,HB-2發酵液和濾液對病原菌菌落直徑與對照比分別降低61.22%和59.18%,B1發酵液和濾液菌落直徑與對照比分別降低55.70%和54.43%,X發酵液和濾液菌落直徑與對照比分別降低54.93%和53.52%,與對照滴加無菌水的處理(抑制率為0)相比,三種芽孢桿菌的發酵液和濾液均能顯著抑制病原菌的菌落擴展(p<0.05),滅活菌液則無明顯抑制效果。

圖1 不同芽孢桿菌對鏈格孢菌的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of different Bacillus strains against Alternaria注:不同標記字母表示同一菌種處理中不同處理液間差異顯著(p<0.05)。

2.4 不同芽孢桿菌揮發性氣體的抑菌活性

由2.1和2.2可知,芽孢桿菌HB-2、B1和X發酵液均能對鏈格孢菌有明顯抑制作用,本試驗采用平板倒扣法對芽孢桿菌發酵液揮發性氣體的抑菌活性進行探究。試驗中,對照組CK的病原菌在培養5 d后菌絲就迅速長滿培養皿,而處理組HB-2、B1和X的揮發性氣體均能有效抑制病原菌的生長(見圖2)。由表3可知,對照組CK的菌落擴展直徑為33.33 mm,芽孢桿菌HB-2、B1和X對病原菌菌落擴展的抑制率分別為80.00%、66.92%和72.11%,這說明三種芽孢桿菌發酵液的揮發性氣體均顯著抑制了病原菌的生長(p<0.05)。同時大量研究也表明,芽孢桿菌發酵過程中產生的揮發性成分對病原菌具有抑制作用[16-18],如Gao等[25]研究表明枯草芽孢桿菌CF-3發酵液產生的揮發性物質能顯著抑制鏈格孢菌、灰葡萄孢霉菌等多種病原菌的菌絲生長,平均抑制率達59.97%,與本試驗結果一致。

表3 不同芽孢桿菌發酵液揮發性氣體的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of volatile gases of different Bacillus

圖2 不同芽孢桿菌揮發性氣體的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of different Bacillus volatile gases

2.5 不同芽孢桿菌揮發性物質的GC-MS鑒定

通過SPME-GC-MS對不同芽孢桿菌發酵過程中的揮發性物質進行分析,依據標準譜庫及相對保留值進行定性,由表4可知,不同芽孢桿菌發酵液產生的揮發性物質種類和含量都具有差異性,芽孢桿菌HB-2、B1和X分別鑒定出28種、31種和30種揮發性物質,主要可分為醇類、酯類、酮類、酸類、酚類、醛類、烴類和其他類化合物。三種芽孢桿菌HB-2、B1和X共有的發揮性物質有2-乙基-1-己醇、2-壬醇、2-癸醇、2,2-二甲基丙酸乙烯酯、2,4-二叔丁基苯酚、1,3-二叔丁基苯、正十四烷、正十六烷、正十二烷、甲氧基苯基肟共10種,且共有揮發性物質峰面積之和分別為21.69%、14.78%和15.01%,其中2-乙基-1-己醇、2-壬醇、2,4-二叔丁基苯酚、正十四烷、正十六烷、甲氧基苯基肟也已被報道存在于其他芽孢桿菌的有效抑菌揮發物質中[19,24]。另外,3-羥基丁酮是芽孢桿菌B1和X發酵液中所有鑒別出的化合物中含量最多的一種,其峰面積分別為25.56%和25.01%,是其主要揮發性物質,且Arrebola等[32]研究表明解淀粉芽孢桿菌PPCB004也能夠產生抑制青霉菌的3-羥基丁酮氣體。因此,3-羥基丁酮可能是B1和X的主要抑菌物質,但其具體抑菌機理仍需進一步研究。

表4 不同芽孢桿菌揮發性物質SPME-GC-MS分析結果Table 4 Results of SPME-GC-MS analysis of volatile substances of different Bacillus

續表

3 討論

本研究活體預防試驗中,三種芽孢桿菌發酵液處理的果實其病原菌菌斑直徑都明顯小于對照組,說明芽孢桿菌對鏈格孢菌的侵染有明顯防治作用。芽孢桿菌的抑菌機制有很多,主要為產生拮抗物質、營養與空間競爭、誘導寄主產生抗性、與病原菌直接作用等方面[26],而本試驗中芽孢桿菌在極早熟桃上對鏈格孢菌的抑制作用可能是由于芽孢桿菌能在果實上提前定殖和生長,與病原菌形成競爭優勢,從而有效地抑制鏈格孢菌的生長。但不同芽孢桿菌在不同果實上的生長特點,對不同病原菌的抑制作用以及兩者間微環境的不同[10],其抑菌機理都會有很大差異,仍需深入研究驗證。另外,三種芽孢桿菌對極早熟桃采后品質也有明顯的保鮮效果。維生素C可以延緩果實衰老,是衡量果實品質的一個重要指標;可溶性固形物含量是水果中各營養物質的綜合表現,它的變化直接反映了果實的營養價值和貯藏品質[27];貯藏期間的桃果實中可滴定酸可維持自身的生命活動,其變化可以反映出果實品質的優劣[14];硬度亦是衡量果實成熟度和品質的重要指標,在桃的貯藏過程中果實中淀粉轉化成可溶性糖,使果實硬度下降,在貯藏期保持一定的硬度可使果實在貨架期能正常后熟軟化[6]。本實驗中三種芽孢桿菌均能顯著降低了極早熟桃采后貯藏腐爛率,延緩果實VC含量、可滴定酸含量和硬度的下降(p<0.05),從而保持貯藏期果實品質。這與文獻[4-5,14]的研究結果一致。

在離體試驗中,芽孢桿菌HB-2、B1和X的發酵液和濾液均能明顯抑制鏈格孢菌的菌絲生長,而滅活菌液沒有明顯抑制作用,這說明加熱失去活性的菌體和次級代謝產物對病原菌是沒有抑制活性的,而發酵液中的活菌和其分泌的次級代謝產物,以及濾液中的次級代謝產物可能都有明顯抑菌作用,但三種芽孢桿菌分泌物質的抑菌機理仍需進一步驗證。

許多微生物在生長代謝過程中都會產生多種揮發性抑菌物質,主要包括醇類、酯類、酮類、醛類、酸類、烴類等化合物,其中芽孢桿菌屬具有廣譜抑菌性,也能產生多種揮發性抑菌物質[17-18,20]。李寶慶等[28]研究表明枯草芽孢桿菌菌株BAB-1能產生少含有17種揮發性抑物質,主要為醇類、酮類、酸類、胺類、烷烴類等,同時明確了其中以甲酸為代表的5種揮發性物質具有抑菌活性;Yuan等[29]研究了解淀粉芽孢桿菌NJN-6菌株產生的11種揮發性物質可以完全抑制香蕉枯萎病菌菌絲的生長和孢子的萌發;郝象瑢等[16]研究了解淀粉芽孢桿菌LJ02菌株在代謝過程中產生的4-乙基苯酚、2-丙基環己酮兩種揮發性氣體均對黑腐皮殼菌有抑制效果。

本研究通過平板倒扣法得出芽孢桿菌HB-2、B1和X發酵液產生的揮發性氣體均能明顯抑制鏈格孢菌的生長,采用GC-MS對三種芽孢桿菌發酵液的揮發性物質成分進行進一步初步分析,鑒定出芽孢桿菌HB-2、B1和X分別能產生揮發性物質28種、31種和30種。與已報道的相關揮發性物質的鑒定結果相比,有2-乙基-1-己醇、壬醛、十二烷醇、正十四烷、2,3-丁二醇、2-壬酮、3-羥基丁酮、2-十一醇、豆蔻酸異丙酯、2,4-二叔丁基苯酚、苯甲醛、甲氧基苯基肟、甘菊藍、2-壬醇等多種相同物質[19,24,30-32],而已報道的2-癸酮、苯并噻唑、二苯并呋喃、甲酸、二甲基二硫、甲基環丙烯等物質在三種芽孢桿菌中未發現[19,24,28-33]。三種芽孢桿菌揮發性物質的抑菌活性不同可能是因為三者的揮發性抑菌物質種類及其含量的存在差異,關于三種芽孢桿菌所產生的揮發性物質的結構特性、抑菌活性及抑菌機理尚不清楚,仍需進一步研究證實。

4 結論

本試驗中供試的三種芽孢桿菌HB-2、B1和X在活體預防試驗和平板對峙試驗中對桃采后主要致病菌鏈格孢菌均有明顯抑制作用,同時三種芽孢桿菌均能顯著抑制早熟桃采后腐爛,維持果實品質;三種芽孢桿菌發酵液產生的揮發性氣體亦能明顯抑制鏈格孢菌的生長,通過SPME-GC-MS法對其揮發性物質成分進行定性分析,分別鑒定得到28種、31種和30種化合物,主要包括醇類、酯類、酮類、酸類、酚類、烴類和其他類化合物,其中2-乙基-1-己醇、壬醛、十二烷醇、正十四烷、2,3-丁二醇、2-壬酮、3-羥基丁酮等多種化合物已被報道存在于其他芽孢桿菌的揮發物質中。芽孢桿菌HB-2、B1和X對極早熟桃采后病害的生物防治具有良好應用潛力,為早熟桃的采后生物防治提供了理論依據。