一株產膠原蛋白酶細菌的鑒定及產酶條件優化

李茂琳,譚 軍,王紅英,王 迪,張 宇,徐 桐,錢斯日古楞,*

(1.大連工業大學生物工程學院,遼寧大連 116034;2.內蒙古河套農牧業技術研究院,內蒙古巴彥淖爾 015000)

膠原蛋白是一種纖維蛋白,在生物結構中起著連接作用,是許多生物體中最豐富的蛋白分子之一,具有良好的生物相容性、低免疫原性、可再生性等功能活性,在食品、保健品、生物藥品、化妝品、新能源功能材料等行業中都有著廣泛的應用[1-3]。因其有特殊的三螺旋多肽鏈結構,分子結構十分穩定,因此難以提取也難以被利用[4]。利用膠原蛋白酶將膠原蛋白的三螺旋結構打開后得到的膠原短肽,更為完整的保留了其生物活性,更易于被人體吸收利用,具有很好的可消化性、抗氧化性、促進皮膚代謝、消除體內自由基等諸多生理活性[5-6]。

目前,已知產膠原蛋白酶的微生物有枯草芽孢桿菌[7]、蠟樣芽孢桿菌[8]、嗜蟲沙雷氏菌、放線菌[9-10]等,其中嗜蟲沙雷氏菌的酶活最高,為98.37 U/mL[11]。微生物源的膠原蛋白酶相比從動物、植物體中分離出的種類少,關于膠原酶產生菌株的開發以及所產膠原酶的研究也相對較少,且大多因產量少、酶活低、安全性低等諸多原因不適合大規模生產[12-13]。有研究表明,海參腸道中存在的大量蛋白酶導致其自溶[14],且溶解后不影響其食用安全性[15],故海參源菌株產出的膠原蛋白酶具有一定的高產性和安全性。

因此,本實驗對一株從海參腸道中分離出的已知產胞外膠原蛋白酶的菌株AL-13進行鑒定及產酶條件優化,以期獲得安全、便捷、高效、低成本、高產量的膠原酶生產方法,為使用膠原蛋白酶獲得膠原蛋白以及對膠原蛋白的利用和工業化生產提供理論依據,具有良好的研究前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產膠原蛋白酶菌株AL-13 本實驗室在前期工作中從海參腸道中篩選、保存并提供;牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 北京奧博星生物技術有限責任公司;聚乙烯醇、吐溫-20、明膠 均為化學純,天津市光復科技發展有限公司;瓊脂、氫氧化鈉、氯化鈉、無水氯化鈣、硫酸銨、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、植酸鈣 均為分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;種子培養基:酵母膏10 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH6.5～8.5;LB培養基:酵母膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,pH7.0～7.4;固體LB培養基:酵母膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,瓊脂2%,pH7.0～7.4。

FA1204B電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;HH-S6/ZK6雙列六孔數顯控溫恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;80-2型離心沉淀機 北京醫用離心機廠;PHS-3B精密pH計 上海雷磁儀廠;HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司;721可見分光光度計 上海第三分析儀器廠;YXQ-50A立氏壓力高溫干熱滅菌鍋 上海博遠實業有限醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的形態特征觀察、生理生化特征分析及16S rDNA基因序列分析 將菌株AL-13涂布于固體LB培養基上,30 ℃條件下培養24 h長出單菌落,觀察其菌落形態特征。在固體培養基平板上挑取單菌落,用無菌水稀釋制成菌懸液,將菌懸液涂于載玻片上自然風干,通過掃描電鏡觀察菌體形態特征;參照《常見細菌系統鑒定手冊》[16]和《伯杰細菌鑒定手冊》[17]進行生理生化特征分析;將菌體移交至大連寶生物工程有限公司進行16S rDNA基因序列分析。

1.2.2 種子液制備、酶活測定

1.2.2.1 種子液的制備 挑選保存于斜面培養基上的單菌落接種至固體平板培養基進行活化,30 ℃恒溫培養24 h,長出菌落后挑取一個飽滿單菌落接種于50 mL液體種子培養基中,置于30 ℃、180 r/min的搖床中搖瓶培養24 h,即得種子液,通過稀釋平板計數法測得此時種子液中細菌的濃度約為108cfu/mL。種子液應于4 ℃保存,使用時間不宜超過3 d。

1.2.2.2 酶活力的測定 參考SB/T10317-1999《中華人民共和國行業標準蛋白酶活力測定法》,采用Folin-酚法,以酪蛋白為底物,酪氨酸為標準物,對發酵上清液中的酶活進行測定[18]。相對酶活為試驗中各因素的吸光度與其中最大吸光度的百分比。

1.2.2.3 酪氨酸標準曲線的繪制 精確配制濃度分別為0、20、40、60、100 μg/mL的酪氨酸標準溶液,與Folin-酚試劑進行顯色反應后分別測定其吸光度,以吸光度值為縱坐標,酪氨酸濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得到線性回歸方程y=0.0101x-0.004,R2=0.9991。酶活定義為在40 ℃條件下,每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的量為1個酶活力單位(U)。

1.2.3 單因素實驗確定培養條件 將AL-13種子液以4%的接種量接種于自然pH的LB培養基中,于30 ℃、180 r/min的條件下搖瓶培養,于30 h取樣測定酶活為16.14 U/mL,此為菌株AL-13優化前的酶活,在此基礎上對菌株AL-13的培養條件及產酶培養基進行優化。

將AL-13種子液以4%的接種量接種于自然pH的LB培養基中,于30 ℃、180 r/min的條件下搖瓶培養,分別于12、24、30、36、48、54、60 h取樣后測定酶活,計算相對酶活,確定最佳培養時間;將菌株以4%接種量接種于自然pH的LB培養基中,在溫度分別為20、25、30、35、40、45、50 ℃的條件下以180 r/min速度搖瓶培養至48 h后,確定最佳培養溫度;將菌株以4%的接種量分別接種于pH為4、5、6、7、8、9、10的LB培養基中,在25 ℃條件下培養48 h后,確定最佳初始pH;將菌株以2%、4%、6%、8%、10%的接種量分別接種至pH為8的LB培養基中,在25 ℃下培養48 h后,確定最佳接種量。

1.2.4 單因素實驗確定培養基組份

1.2.4.1 碳源及碳源濃度對產酶的影響 以1.2.3得到的最佳培養條件為基礎,固定LB培養基其他成分,分別選取蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉作為唯一碳源,濃度均為10 g/L,搖瓶培養后測定酶活,計算相對酶活,確定最佳碳源;添加濃度分別為1、3、5、10、15、20 g/L的最佳碳源物質,搖瓶培養后測定相對酶活,確定最佳濃度。

1.2.4.2 氮源及氮源濃度對產酶的影響 確定葡萄糖濃度10 g/L,固定LB培養基其他成分不變,分別選取酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、明膠、尿素、硫酸銨為唯一氮源,添加量均為10 g/L,搖瓶培養后確定最佳氮源;添加濃度分別為1、3、5、10、15、20 g/L的最佳氮源物質,搖瓶培養后確定最佳濃度。

1.2.4.3 氯化鈉濃度對產酶的影響 采用最佳碳源和氮源的最佳濃度,添加氯化鈉濃度分別為0.5、1、3、5、10、15 g/L,搖瓶培養后確定最佳氯化鈉濃度。

1.2.4.4 金屬離子及離子濃度對產酶的影響 向單因素確定的最佳培養基中額外添加鈣離子、銅離子、鎂離子、亞鐵離子、鋅離子、錳離子,使其濃度分別達到0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.60、1.00 g/L,以不額外加金屬離子的培養基為對照,搖瓶培養后確定最適金屬離子及濃度。

1.2.4.5 產酶促進劑及濃度對產酶的影響 許多產酶促進劑能夠促使蛋白酶產生菌的生長繁殖,對有些酶起到激活作用,提高產酶量[19]。在1.2.4.4已確定的培養基組份中分別添加聚乙烯醇、醋酸鈉、吐溫-20、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、植酸鈣,添加量均為3 g/L,以不加產酶促進劑的培養基為對照,搖瓶培養后確定最佳產酶促進劑;選取濃度為1、3、5、10、15 g/L的最佳產酶促進劑物質,搖瓶培養后確定其濃度。

1.2.5 響應曲面法優化培養基 在單因素實驗確定培養基組成成份的基礎上,以培養基組份中的五個因素為研究對象,采用響應面試驗設計考察培養基各組分的主效應及交互效應對菌株積累膠原蛋白酶的影響,對培養基的組成進一步優化[20]。采用Box-Behnken的中心組合設計原理,設計5因素3水平的響應面試驗,以葡萄糖(A)、牛肉膏(B)、氯化鈣(C)、磷酸氫二鉀(D)、氯化鈉(E)為自變量,發酵液內膠原蛋白酶活性Y(U/mL)為響應值。每組實驗設三個平行,重復兩次,取各組數據的均值進行響應面回歸分析。試驗因素與水平的選取見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.3 數據處理

菌株鑒定結果通過NCBI中BLAST功能進行同源性比對分析,選取與實驗菌種同源性90%以上的菌株分析比對結果并使用MEGA6.0軟件構建系統發育樹;單因素試驗優化培養條件用Excel 2003進行數據處理,并用Origin 9.0作圖;用SPSS 21.0軟件進行方差分析(ANOVA);用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行多元回歸擬合,并對46組試驗結果進行響應面回歸分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的生理生化特征測定及菌種鑒定

AL-13在固體平板培養基上的菌落為乳白色圓形,直徑約2～5 mm,菌落不透明,表面光滑,邊緣整齊,中間微凸起,有輕微辛辣味。在掃描電鏡下放大6900倍,如圖1,菌體為橢圓形,直徑約1.3～1.8 μm。

圖1 AL-13掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of AL-13

AL-13的生理生化特征鑒定見表2。結果表明該菌為革蘭氏陰性菌,有芽孢生成,可降解明膠,生長過程中產酸產氣,具有接觸酶、氧化酶、淀粉酶等多種酶活性。

表2 AL-13生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of AL-13

將與AL-13的16S rDNA基因序列同源性90%以上的序列構建系統發育樹,由圖2可知該菌與Brevibacilluslaterosporusstrain BGSC 40A10、Brevibacilluslaterosporusstrain KMM5等12株菌的親緣關系非常近,尤其與Brevibacilluslaterosporusstrain NRRL NRS-314的同源性達到了100%,結合形態特征、生理生化特征可將菌株AL-13鑒定芽孢桿菌屬中的側孢短芽孢桿菌。

圖2 AL-13的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of AL-13

2.2 培養條件單因素實驗結果

2.2.1 培養時間的確定 由圖3a可知,在培養12 h時細菌開始產酶,在培養至24 h時,酶積累量開始快速增多,到48 h相對酶活達到最高,48 h后開始下降。這可能是因為在發酵培養前期菌量多,使得酶積累量增多,到后期菌體逐漸轉變為芽孢,不再產酶,而原先積累的酶又有所消耗,使得相對酶活降低。因此確定最佳培養時間為48 h。

圖3 不同培養條件下所產膠原蛋白酶的相對酶活變化Fig.3 Changes of relative enzyme activity of collagen proteinase produced under different culture conditions

2.2.2 培養溫度的確定 由圖3b可知,在25 ℃的條件下培養,相對酶活達到最高,繼續提高溫度,相對酶活開始降低,至45 ℃時幾乎失活,因此確定最佳培養溫度為25 ℃。由于海洋環境溫度較低,此為海洋菌株,所以培養溫度相對較低[21]。

2.2.3 初始pH的確定 由圖3c可知,菌株在初始pH小于6、大于9的培養基中培養,相對酶活隨著pH逐漸極端化在快速降低,而在pH為6～9的條件下培養,相對酶活較高,在初始pH為8時,相對酶活達到最大值,因此確定最佳初始pH為8,這與Yang等[22]對側孢短芽孢桿菌的研究一致。

2.2.4 接種量的確定 由圖3d可知,當接種量由2%開始增加時,相對酶活逐漸增大,這可能是因為增加初始菌體的量導致菌體生長加快、發酵周期縮短。當接種量達到6%時,相對酶活達到最高,高于6%后又出現下降趨勢,這可能是因為過高的接種量使得底物更多的用于菌體生長,而用于產酶的量減少[23]。因此確定最佳接種量為6%。

2.2.5 最優培養條件下酶活 得到菌株AL-13產膠原蛋白酶的最佳培養條件為:培養時間48 h、培養溫度25 ℃、初始pH8.0、接種量6%。在此培養條件下使用LB培養基進行培養,酶活達到73.77 U/mL,比優化前(16.14 U/mL)提高了約4.5倍。

2.3 培養基單因素優化結果

2.3.1 最佳碳源及碳源濃度的確定 如圖4a所示,以葡萄糖為碳源時,相對酶活達到最高,因此選擇葡萄糖作為最佳碳源;如圖4b所示,葡萄糖濃度由1 g/L增加到10 g/L時,相對酶活快速升高,當葡萄糖濃度大于10 g/L時相對酶活開始下降,這可能是因為高濃度的葡萄糖增大了細胞的滲透壓,抑制菌體的生長[24]。因此培養基葡萄糖初始濃度應控制在10 g/L。

圖4 培養基單因素篩選結果Fig.4 Single factors screening of culture medium

2.3.2 最佳氮源及氮源濃度的確定 如圖4c所示,以牛肉膏為氮源時,相對酶活遠高于其他氮源,且牛肉膏的營養物質含量豐富,含氮量也高于其他氮源[25],因此選擇牛肉膏作為最佳氮源;如圖4d所示,牛肉膏濃度由1 g/L增加到10 g/L時,相對酶活持續上升,當牛肉膏濃度大于10 g/L時相對酶活開始下降,因此培養基牛肉膏初始濃度應控制在10 g/L。

2.3.3 氯化鈉濃度的確定 不同的鹽濃度對菌體產酶也有一定的影響,如圖4e所示,氯化鈉濃度由1 g/L增加到10 g/L時,相對酶活快速上升,當氯化鈉濃度大于10 g/L時則開始下降,因此培養基氯化鈉初始濃度應控制在10 g/L,產生此種現象的原因還需要進一步的研究。

2.3.4 金屬離子及離子濃度的確定 如圖4f所示,鈣離子、鎂離子和錳離子對產酶均有促進作用,其中鈣離子的促進作用更為顯著。這與一定濃度的鈣離子對大多數酶都具有激活作用的現象一致,鈣離子結合在酶的特定位點,可以加強酶的穩定性[26]。亞鐵離子隨其濃度增加,由促進轉為抑制。銅離子和鋅離子對產酶有明顯抑制作用。綜上所述,金屬離子選擇鈣離子,添加濃度控制在0.2 g/L。

2.3.5 產酶促進劑及濃度的確定 如圖4g所示,磷酸氫二鉀膠原蛋白酶相對酶活最高,這可能是由于磷酸鹽為微生物的生長提供了營養[27],因此選擇磷酸氫二鉀為最佳產酶促進劑。如圖4h所示,磷酸氫二鉀濃度大于5 g/L時,酶活開始呈現下降趨勢,因此磷酸氫二鉀濃度應控制在5 g/L。

2.4 培養基響應面實驗結果

2.4.1 Box-Behnken實驗設計及結果 Box-Behnken試驗方案及結果見表3。根據Box-Behnken結果,利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行擬合,得到五個自變量因素的二次多項回歸方程:Y=144.27-14.78A+19.67B+0.49C-10.97D+7.91E-22.96AB+2.85AC-9.01AD+16.41AE-7.35BC-18.41BD-20.47BE+28.88CD+1.62CE-0.87DE-23.65A2-53.65B2-23.69C2-21.04D2-19.46E2。

表3 Box-Behnken實驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由F檢驗可知,各因素對酶活的影響主次順序為:B>A>D>E>C,其中葡萄糖、牛肉膏、氯化鈣、磷酸氫二鉀均對酶活的線性影響極顯著;各因素的交互作用中AC、BC、CE、DE曲面效應不顯著,AD顯著(p<0.05),AB、CD、BE、BD、AE達到極顯著(p<0.0001)。而在各因素的平方項中,A2、B2、C2、D2、E2均達到了極顯著(p<0.0001),表明各因素對酶活的影響較大。

2.4.3 響應曲面及等高線分析 對交互作用曲面效應達到極顯著和顯著水平的因素利用Design-Expert繪制響應曲面圖和等高線圖,即葡萄糖和牛肉膏濃度、磷酸氫二鉀和氯化鈣濃度、氯化鈉和牛肉膏濃度、葡萄糖和氯化鈉濃度、磷酸氫二鉀和牛肉膏濃度、磷酸二氫鉀和葡萄糖濃度對膠原蛋白酶活性的影響的響應曲面圖和等高線圖。如圖5所示。

圖5 交互作用極顯著因素對酶活影響的響應曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction of very significant factors on enzyme activity注:(a):葡萄糖和牛肉膏濃度對酶活性的影響;(b):葡萄糖和氯化鈉濃度對酶活性的影響;(c):氯化鈉和牛肉膏濃度對酶活性的影響;(d):磷酸氫二鉀和牛肉膏濃度對酶活性的影響;(e):磷酸氫二鉀和氯化鈣濃度對酶活性的影響;(f):葡萄糖和磷酸氫二鉀濃度對酶活的影響。

響應曲面的坡度變化、等高線的形狀及緊密程度都反映著因子之間的交互作用,響應曲面坡度的平緩與陡峭程度可以表明培養基含量變化對膠原蛋白酶活力的響應靈敏程度。等高線的形狀可以反映交互項對響應值影響的強弱,圓形表示交互作用對響應值的影響不顯著,橢圓形表示交互作用對響應值的影響顯著[31]。由圖5可以直觀的反映出AB、CD、BE、BD、AE、AD之間的交互作用均對側孢短芽孢桿菌產膠原酶的酶活有顯著影響(p<0.05或p<0.01),等高線圖均呈橢圓形,進一步說明交互作用的顯著性。

2.4.4 最佳產酶條件的確定及驗證試驗 從圖5中可看出膠原酶活力響應值存在最大值,由求得的最優回歸方程得到酶活力達到最大值時的最優培養基為:葡萄糖8.14 g/L、牛肉膏11.63 g/L、氯化鈣0.17 g/L、磷酸氫二鉀2.08 g/L、氯化鈉9.48 g/L,此時的最大酶活力為154.89 U/mL。為檢驗試驗結果的可靠性,采用優化后的培養基進行3次平行試驗。得到的酶活分別為157.13、149.28、152.76 U/mL,平均值為(153.06±3.73) U/mL,此結果與預測值接近,相對誤差為0.04%,表明該模型能夠準確的預測實際值,具有一定的實用價值。

3 結論

通過菌株的形態特征、生理生化特征及菌種鑒定得出實驗菌株AL-13為側孢短芽孢桿菌。對其產膠原蛋白酶的條件進行優化,得到最適培養條件為培養時間48 h、培養溫度25 ℃、初始pH8.0、接種量6%,最適培養基為葡萄糖8.14 g/L、牛肉膏11.63 g/L、氯化鈣0.17 g/L、磷酸氫二鉀2.08 g/L、氯化鈉9.48 g/L。在該產酶條件下膠原蛋白酶活力預測值為154.89 U/mL,驗證培養得到膠原蛋白酶活力為(153.06±3.73) U/mL,產酶條件優化后的酶活(153.06 U/mL)較優化前(16.14 U/mL)提高了9.5倍。本實驗成功優化了一株產膠原蛋白酶細菌的產酶條件,為微生物來源的膠原蛋白酶的研究提供了一定的理論指導,對將膠原蛋白酶大規模的應用于實際生產以獲得高質量的膠原短肽提供了理論依據,具有良好的研究前景。