藍莓果汁貯藏中非酶褐變影響因素評價

王 鑫,魏 婧,2,馬 蕊,馬永強,*

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院，省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076;2.濰坊市皓遠食品有限公司,山東濰坊 261000)

藍莓(Blueberry)為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)常綠灌木,其果皮呈藍色(或藍黑色)故稱藍莓[1]。藍莓果很小,但口感極佳,可直接食用,也可以加工成果汁飲料、果醬和果酒飲品等[2-3]。果汁褐變分為酶促褐變(Enzymatic browning)和非酶促褐變(Non-enzymatic browning),酶促褐變主要發生于果汁加工過程中,且反應機制已廣泛研究,而非酶促褐變反應機制復雜,不僅在果汁加工和貯藏過程中常見,同時可促使果汁貯藏壽命減短。

多元酚氧化縮合反應、美拉德反應、焦糖化反應以及抗壞血酸氧化分解反應可引起果汁非酶褐變,并對不同果汁影響大小不同[4]。目前,很多學者對各類果汁貯藏過程中非酶褐變反應進行了研究,Roig等[5]通過桔汁儲藏實驗發現,由于抗壞血酸發生氧化降解導致儲藏過程中美拉德反應對其發生非酶褐變作用不顯著,同時氨基化合物可促進非酶褐變發生。Marti等[6]研究表明,向果汁中過多添加抗壞血酸會致使褐變程度加重。Paravisini等[7]發現蘋果汁在35 ℃下儲存時,非酶褐變主要與多元酚類化合物有關。Macdonald等[8]發現香蕉汁在殺菌過程中,顏色變化的主要原因是焦糖化反應。張添等[9]研究發現在蘆薈制品加工和貯存過程中,多酚類物質的濃度是造成非酶褐變的主要原因。國內對藍莓的研究起步較晚,目前主要集中于藍莓的生物活性功能方面的研究,對藍莓汁非酶促褐變反應方面尚未進行深入研究,對預防藍莓汁非酶褐變的研究對于提高藍莓汁品質具有重要意義。

本實驗選用三氯乙酸(TCA)作為酶促褐變反應終止劑,對藍莓汁分別在4、25 和37 ℃下進行貯藏,以總酚、褐變指數(BI)、5-羥甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural,5-HMF)含量以及抗壞血酸含量為考查指標,對藍莓汁貯藏過程中非酶因素進行評價,為抑制和降低褐變程度提供有力依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓(-18 ℃下貯存) 大興安嶺百盛藍莓科技開發有限公司;三氯乙酸(TCA) 天津永大化學實際有限公司;抗壞血酸 天津博迪化工股份有限公司;2,6-二氯靛酚、福林酚 國藥集團化學試劑有限公司;亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉 湖北邦盛化工有限公司;鄰苯二酚 鄭州盛凱化工產品有限公司;乙酸鋅 天津市巴斯夫化工有限公司;草酸 哈爾濱市新達化工廠;D001強酸大孔苯乙烯系陽離子交換樹脂 上海維塔化學試劑有限公司。

BS 224S型分析天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司;LG10-2.4A型高速離心機 北京京立離心機有限公司;R-205型旋轉蒸發器 上海申勝生物技術有限公司;V-5000可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;恒溫搖床培養箱 上海智誠分析儀器制造有限公司;ZD-2型自動電位滴定儀 上海儀田精密儀器有限公司;UV1000單光束紫外-可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓果汁的制備 將藍莓果室溫下自然解凍,在榨汁機中破碎15 s,將得到的藍莓汁在4000 r/min下離心15 min,過濾,取上清液分裝于100 mL玻璃瓶中,即為藍莓果汁樣品。并存入4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 非酶促褐變反應各體系的建立 按照表1進行體系的建立。

表1 不同體系的成分表Table 1 Composition table of different systems

1.2.2.1 體系1的建立 為研究抗壞血酸分解反應、美拉德反應、焦糖化反應及多元酚氧化縮合反應對藍莓果汁非酶促褐變的影響建立體系1,且由于體系1只抑制了酶促反應可研究總酚含量的變化。參照田玉庭[10]的試驗方法,取一定量的藍莓果汁樣品利用三氯乙酸來終止酶促反應,按1 mL多酚氧化酶粗酶液(兩層紗布過濾,4 ℃,10000 r/min離心30 min)加等量TCA,其中TCA濃度逐步為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%八個濃度梯度直至令其反應終止,添加0.05 mol/L鄰苯二酚2 mL,用分光光度計在410 nm下測定樣品的OD值,每隔30 s讀數,觀察吸光值變化情況。算出所對應酶活(每分鐘增加0.001吸光值即為1單位活力)并作圖。

1.2.2.2 體系2的建立 根據1.2.2.1確定體系1中TCA濃度為12%后,用陽離子交換樹脂處理體系1的藍莓汁,去除氨基酸[11]。此體系的建立是為了研究焦糖化、抗壞血酸氧化分解及多元酚氧化縮合對非酶促褐變的影響。具體操作為:為去除氨基酸形式所存在的氮元素以去除氨基酸,進行D001大孔苯乙烯系強酸陽離子交換樹脂對氨基態氮靜態交換吸附實驗,向藍莓汁中添加不同含量的D001陽離子交換樹脂(0、5%、10%、15%、20%),每30 min攪拌一次,在室溫下放置15 h,原果汁作為未處理的空白組,每隔2小時測定20 h內原果汁和交換吸附后果汁的氨基態氮的濃度,篩選最佳陽離子交換樹脂添加量。之后向藍莓果汁中添加最適含量的D001陽離子交換樹脂,步驟同上,求出表觀交換吸附量，獲得陽離子交換樹脂交換吸附平衡時間。

式(1)

式中:Q-表觀吸附量(mg/g);C0-起始濃度(mg/mL);Ct-某時間點的濃度(mg/mL);V-吸附溶液的體積(mL);W-樹脂濕質量(g)。

1.2.2.3 體系3的建立 此體系的pH=2(抗壞血酸(VC)在pH=2時氧化反應緩慢而不明顯)。體系3的建立是為了研究焦糖化反應和多酚氧化縮合反應對非酶促褐變的影響[12]。具體操作為:藍莓樣液加1 mL TCA經離心(4000 r/min 15 min)后,分別取10 g藍莓汁于試管中按不同比例分別添加亞硫酸鹽,以不添加亞硫酸鹽為對照組,90 ℃水浴5 h,測定A420值并計算其非酶褐變抑制率。其中,添加亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉的濃度梯度均選用為50、100、150、200、250、300 μg/g。

即利用相減法可得,體系1-體系2間所發生的是美拉德反應,而體系2-體系3之間發生的是抗壞血酸氧化分解反應。

1.2.3 貯藏實驗 各體系樣液分別于4、25和37 ℃條件下貯藏50 d,每5 d測定褐變指數、5-HMF、VC、總酚等相關指標。

1.2.4 褐變指數的測定及抑制率計算 果汁的褐變度用420 nm波長處的吸光度(A420)表示。取適量待測果汁樣品,于9000 r/min離心20 min,取上清液,測定A420值,以水為空白[13]。

式(2)

式中:T為抑制率,%;A0為420 nm處未加抑制劑的藍莓汁的吸光度;Ai為420 nm處加入抑制劑的藍莓汁的吸光度[14]。

1.2.5 VC含量測定 采用電位法測定[15-16]。

1.2.6 氨基態氮的測定 采用GB/T 5009.39-2003方法測定。

1.2.7 5-羥甲基糠醛含量測定 取藍莓汁樣品5 g,用25 mL蒸餾水稀釋溶解后,移入50 mL容量瓶,加入0.5 mL澄清劑Ⅰ(15% 亞鐵氰化鉀)、搖勻;再加入0.5 mL澄清劑Ⅱ(30%乙酸鋅),搖勻,用蒸餾水定容至刻度。于9000 r/min離心10 min,吸取上層清夜各5 mL于2個10 mL比色管中。在一個比色管中加入5 mL 0.20 g/100 mL NaHSO3溶液,混勻,為參比液;另一個比色管中5 mL蒸餾水,混勻,為待測液。用石英比色皿于284 nm和336 nm波長處測定待測樣液的吸光度[17-18]。

式(3)

式中:X為藍莓汁樣品中5-HMF的含量,mg/100 g;m為樣品質量,g;14.97為換算系數。

1.2.8 總酚含量的測定 福林-酚比色法測定[19],總酚標準曲線繪制:測定沒食子酸濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL時吸光度,得到標準曲線方程為：y=1.9522x+0.0585,R2=0.981。

1.3 數據處理

采用DPS 9.50軟件進行數據處理,數據用Mean±SD表示。圖表采用Excel 2013和Origin 8.5完成。

2 結果與分析

2.1 各體系樣品預處理條件篩選結果

2.1.1 體系1中三氯乙酸濃度的確定 由圖1可知,隨TCA添加濃度的上升,酶活性逐漸下降,當TCA添加濃度為14%時,酶活力為-0.0018 U/g,酶的活力只能為0或正值,負值并無意義。同時也可看出,各濃度下的三氯乙酸對酶促反應都起到了一定的抑制作用。經比較,最終選用添加TCA濃度為12%(處理后即為體系1樣品)。

圖1 三氯乙酸濃度對酶活力的影響Fig.1 Effects of trichloroacetic acid concentration on enzyme activity

2.1.2 體系2中D001陽離子交換樹脂的篩選 由表2可得,不同含量的陽離子交換樹脂對藍莓果汁中氨基態氮含量的影響不同,體系2藍莓汁樣品中添加D001陽離子交換樹脂含量為10%、15%時對氨基態氮含量的影響差異不明顯,隨著樹脂添加量增加表觀吸附量趨于平衡,且無明顯差異。因此選擇填加D001陽離子交換樹脂含量為10%時吸附作用最適。

表2 不同含量樹脂對果汁中氨基態氮的影響Table 2 Effects of different fruit juice contents on resin amino nitrogen

向藍莓果汁中加入10%含量D001陽離子交換樹脂,隨著吸附時間的增加,氨基態氮含量逐漸降低,且吸附量逐漸增大,當超過16 h后,氨基態氮的表觀交換吸附量趨于無顯著差異的穩定狀態(見表3),說明吸附作用達到平衡,因此D001陽離子交換樹脂交換吸附平衡時間為16 h。

表3 10% D001陽離子交換樹脂對氨基態氮的影響Table 3 Effects of 10% D001 cation exchange resin on of amino nitrogen

2.1.3 體系3中亞硫酸鹽的篩選 如圖2所示,無論是亞硫酸鈉還是亞硫酸氫鈉對藍莓果汁褐變均有一定的抑制作用,隨著濃度的提高,抑制率也相應增大,當濃度≥200 μg/g時,則趨于平衡狀態,相對而言,亞硫酸氫鈉的抑制效果更為明顯,所以本試驗選取濃度為200 μg/g的NaHSO3添加到藍莓汁中,即構成體系3樣品。

圖2 亞硫酸鹽對藍莓果汁褐變的抑制Fig.2 Sulfite inhibition of blueberry juice browning

2.2 非酶褐變反應對藍莓汁在貯藏過程中主要因素的影響

2.2.1 褐變指數的變化 在貯藏過程中,各體系藍莓汁A420值均有上升趨勢,但增加程度不同,如圖3所示,貯藏50 d時,當溫度為37 ℃時,體系1的A420值分別是體系2和體系3 A420值的1.03倍和1.76倍;當溫度為25 ℃時,體系1的A420值分別是體系2和體系3 A420值的1.1倍和1.86倍;當溫度為4 ℃時,體系1的A420值分別是體系2和體系3 A420值的1.37倍和1.71倍,褐變指數均呈現出體系1>體系2>體系3的規律,體系1-體系2間所發生的是美拉德反應,而體系2-體系3之間發生的是抗壞血酸氧化分解反應,且從圖中體系1、2、3曲線相差幅度可看出抗壞血酸氧化分解反應褐變程度比美拉德反應嚴重。

圖3 褐變指數的變化Fig.3 Changes browning index注:a為4 ℃貯藏下各體系A420的變化;b為25 ℃貯藏下各體系A420的變化;c為37 ℃貯藏下各體系A420的變化。

2.2.2 VC含量的變化 由于抗壞血酸極易氧化分解,并可與氨基酸發生反應生成紅色素和黃色素,因此選取藍莓汁+TCA的體系1可體現抗壞血酸含量的變化,圖4中可以看出抗壞血酸隨貯藏時間的延長有一定的降解,不同貯藏溫度下,其降解程度不同,前5 d內急劇下降,隨后貯藏期間VC降解的速率相對緩慢,這一現象與Rolga等[20]研究的柑橘汁和萬鵬[21]研究的荔枝果汁中抗壞血酸的變化規律十分相似。

圖4 貯藏過程中藍莓汁抗壞血酸的變化(體系1)Fig.4 Changes during storage blueberry juice ascorbic acid(System 1)

2.2.3 總酚含量的變化 果汁中的多元酚不僅僅可以與蛋白質作用形成聚合物使其含量減少,導致果汁混濁,還可以自身進行氧化縮合、與果汁體系中其他物質發生共色作用,最終導致果汁非酶褐變,影響果汁品質[22-23]。如圖5可知,沒食子酸的濃度與吸光度呈現良好的線性關系,R2=0.981。將體系1藍莓果汁樣品分別置于4、25和37 ℃下貯藏,總酚含量隨時間增加而逐漸下降(圖6)。貯藏50 d后,各溫度下總酚含量分別損失了2.1%、7.2%和9.4%,變化不是很明顯,該結果表明,總酚含量的變化是引起藍莓汁非酶褐變的原因之一,但不是主要原因。

圖5 總酚的標準曲線Fig.5 Standard curve of total phenols

圖6 貯藏過程中藍莓汁總酚含量變化(體系1)Fig.6 Changes during storage blueberry juice total phenol content(System 1)

2.2.4 5-HMF含量的變化 體系1為研究抗壞血酸分解反應、美拉德反應、焦糖化反應及多元酚氧化縮合反應對藍莓果汁非酶促褐變的影響,且5-HMF是衡量果汁褐變的重要指標之一,是美拉德反應、焦糖化反應以及抗壞血酸氧化分解反應的共同中間產物[24-25],因此選取體系1為研究對象,如圖7所示,藍莓汁貯藏50 d時,37 ℃下5-HMF總含量分別為25、4 ℃貯藏下的1.2倍和1.8倍,總體而言,貯藏溫度不斷提高,5-HMF含量也隨之增加。因此可以5-HMF為重要測定指標來評價這三種反應分別對藍莓汁在貯藏過程中的作用大小。

圖7 貯藏過程中藍莓汁非酶褐變5-HMF總量(體系1)Fig.7 Storage blueberry juice non-enzymatic browning 5-HMF total process(System 1)

2.2.5 焦糖化反應對藍莓汁非酶褐變的影響 果汁中甜味的主要來源是糖,糖類除了與氨基化合物發生美拉德反應外,在加工或貯藏過程中高溫、酸性及高糖濃度條件下,極易發生焦糖化反應。體系3在體系1的基礎上經過添加200 μg/g NaHSO3來抑制美拉德反應的產生,以確定焦糖化反應對非酶褐變的影響,同時調節pH=2,使VC在整個貯藏期穩定不易分解(圖8)。如圖9所示,藍莓汁貯藏前5 d時,4,25和37 ℃這三種貯藏條件下5-HMF均有所上升,其原因是貯藏時將藍莓汁樣品裝入玻璃瓶中封蓋時空隙中殘留空氣中的氧氣與果汁中抗壞血酸有氧分解而導致的,耗完氧后,褐變指數不顯著,無變化,這一結果表明,焦糖化反應幾乎對其非酶促褐變無影響,相對于其他反應而言,可忽略不計。

圖8 貯藏過程中藍莓汁抗壞血酸(VC)的變化(體系3)Fig.8 Ascorbic acid(VC)of blueberry juice changes during storage(System 3)

圖9 貯藏過程中藍莓汁5-HMF的變化(體系3)Fig.9 5-HMF changes of blueberry juice during storage(System 3)

2.2.6 抗壞血酸氧化分解對藍莓汁非酶褐變的影響 利用相減法體系2-體系3即體現抗壞血酸氧化分解反應是藍莓汁非酶促褐變的影響,由2.2.5結論可知,焦糖化反應對藍莓汁非酶褐變的影響可忽略不計,即體系2所得數據結果主要是由抗壞血酸氧化分解反應所導致。如圖10所示,所測得的5-HMF含量為抗壞血酸氧化分解與焦糖化反應所產生5-HMF之和,根據2.2.5分析結果表明,可視體系2所測5-HMF為抗壞血酸氧化分解而得。低溫情況下,5-HMF生成量甚少,即VC分解緩慢,無明顯特征。隨貯藏溫度上升,5-HMF生成量逐漸增加,25 ℃和37 ℃下貯藏前5 d,5-HMF生成速率極快,隨后5～45 d,逐漸增長,當貯藏50 d時,4、25和37 ℃條件下產生的5-HMF含量分別為0.075、0.165、0.19 mg/100 mg。由此可得,抗壞血酸氧化分解對非酶褐變反應有一定程度的影響。

圖10 貯藏過程中藍莓汁5-HMF的變化(體系2)Fig.10 5-HMF changes of blueberry juice druing storage(System 2)

2.2.7 美拉德反應對藍莓汁非酶褐變的影響 以5-HMF這一理化指標為基準,利用相減法(體系1-體系2)所得到的5-HMF含量,即由美拉德反應所生成。從圖11可以觀察到各個溫度下,體系2產生的5-HMF含量遠遠大于體系1-2的值,經數據分析可得,各貯藏溫度下抗壞血酸氧化分解反應產生5-HMF的含量分別是美拉德反應產生5-HMF含量的3、5.5、5.4倍。結果表明,美拉德反應在藍莓汁貯藏過程中的作用僅占一小部分,相對而言,影響藍莓汁非酶褐變程度大小為:抗壞血酸氧化分解反應>美拉德反應>焦糖化反應。

圖11 模擬體系在貯藏50d后產生的5-HMF含量比較Fig.11 Compare of 5-HMF contents in simulation system after 50 d storage

3 結論

實驗構建三個不同藍莓汁體系,分別置于4、25和37 ℃條件下貯藏50 d,隨時間和溫度的變化,藍莓汁呈現出不同程度非酶褐變,其中總酚含量在整個貯藏過程中變化不大,因此總酚對于藍莓汁非酶褐變的影響較小。利用相減法分析得出各反應分別產生5-HMF大小排列為抗壞血酸氧化分解反應>美拉德反應>焦糖化反應,可見抗壞血酸對其影響最大,從而揭示藍莓汁在貯藏過程中非酶褐變機制對褐變指數、總酚、抗壞血酸和5-羥甲基糠醛各指標影響大小,對后續的非酶褐變機理深入研究有著重要的意義。