土三七提取物對尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎的緩解作用

曹 塬,劉 杰

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

痛風性關節炎是由于嘌呤代謝紊亂、尿酸產生過多或排泄障礙,造成血尿酸濃度增高,尿酸鈉結晶沉積于關節導致的一種以關節疼痛、腫脹、畸形為主的疾病[1]。在急性發作期,病變關節滑膜炎性細胞浸潤、表面充血水腫、組織局部壞死,并伴隨關節積液及周圍組織中炎癥因子如白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1α(IL-1α)含量均顯著增多[2-4]。病發時主要表現為關節紅、腫、熱、痛,常因飲酒、高嘌呤飲食等誘發,是成年人常見的炎性關節疾病之一[5-6]。目前西藥對于痛風性關節炎的治療主要是控制發作癥狀,但復發率高,很難阻滯疾病進程或根治,且西藥大多不良反應大,危害患者健康[7]。有研究報道中醫藥治療痛風具有很好的療效,且不會產生嚴重副反應[8-9]。

土三七常種植于我國云南、廣東、四川、浙江、江蘇等省,因其藥食同源的特點而被大眾所知[10]。其具有補血活血、消腫散瘀的功效,有研究表明土三七有抗菌消炎、抗HIV活性[11]。基于土三七的抗炎作用,對于其改善痛風性關節炎作用尚未出現有關報道,故本研究對土三七提取物(Garcinia Extract,GE)治療尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎進行了初步探索,以期為進一步研究土三七用于防治痛風性關節炎奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GE(土三七提取物) 喜樂福酒業有限公司;試驗動物 180～220 g Sprague Dawley(SD)大鼠,合格證編號:SCXK(湘)2016-0002,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;輻照鼠料 北京科澳協力飼料有限公司;尿酸鈉晶體 Sigma公司;氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司;ELISA試劑盒 杭州聯科生物技術股份有限公司;羧甲基纖維素鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

IVC獨立通氣籠設備 蘇州馮氏實驗動物設備有限公司;WH-985-C7恒溫振蕩培養箱 泰宏醫療器械有限公司;H1850臺式高速冷凍離心機 離心機儀器有限公司;PL-DNM-9602酶標分析儀 北京普朗新技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組與造模 50只SD大鼠適應性喂養一周后,按體重隨機平均分為5組,每組10只。分組情況:正常組、急性痛風性關節炎模型組、GE高劑量組(300 mg/kg)、GE中劑量組(200 mg/kg)、GE低劑量組(100 mg/kg)。首先將樣品GE溶于生理鹽水中,加入適量的羧甲基纖維素鈉配制成對應濃度的混懸液。實驗前6 d,藥物組按1.0 mL/kg灌胃,其他組給予等量生理鹽水,每天一次。末次給藥1 h 后,將大鼠麻醉后仰臥固定,將左踝關節彎曲,用注射器自兩骨突之間進針,注入3%無菌尿酸鈉溶液100 μL,以關節囊對側鼓起為注入標準,制備急性痛風性關節炎模型[12-13]。正常組大鼠關節注射等體積的無菌生理鹽水。

1.2.2 大鼠步態評分及關節周徑測量 分別于造模后6、8、12、24、48 h對各組大鼠步態進行評分。評分標準[14]為：0分為正常步態,雙足均勻著地;1分為輕度跛行,受試下肢略有彎曲;2分為中度跛行,受試下肢剛觸及地面;3分為重度跛行,受試下肢離開地面,三足著地行走。

于造模前及造模后 6、8、12、24、48 h后分別在受試踝關節相同部位,用無彈性軟尺測量每組大鼠的踝關節周長,記錄數據。并觀察造模前后受試大鼠關節周長的變化。通過測量不同致炎時間各組大鼠踝關節周徑,計算對相應時刻大鼠關節腫脹度及藥物抑制率,計算公式如下[15]:

某時刻腫脹率(%)=致炎t時間踝關節周徑-致炎前踝關節周徑/致炎前踝關節周徑×100

式(1)

某時刻抑制率(%)=模型組t時腫脹率-給藥組t時仲脹率/模型組t時腫脹率×100

式(2)

1.2.3 關節組織病理學檢測 造模48 h后,處死大鼠取其病損關節,加4%多聚甲醛溶液固定,常規脫水、透明、包埋、切片,進行HE染色,于顯微鏡下觀察關節滑膜組織病理形態學改變。

1.2.4 炎癥因子含量測定 于造模48 h處死大鼠,腹主動脈取血,靜置30 min后,3000 r/min離心20 min,取上清液分裝與EP管中,置于-80 ℃凍存。采用雙抗體夾心ELISA法檢測IL-1β、IL-1α、TNF-α含量,根據試劑盒使用說明進行實驗操作。

2 結果與分析

2.1 GE對大鼠步態及關節腫脹度的影響

于造模0、6、8、12、24、48 h分別對各組大鼠進行步態分析及評分,正常組大鼠步態正常,活動自如;模型組大鼠活動明顯減少,行走時出現明顯跛行,食量減小,飲水次數減少,步態評分較正常組顯著升高(p<0.05)，提示造模成功,模型組大鼠在造模8～12 h期間步態評分達到最高;與模型組相比,GE低、中、高劑量組大鼠步態有明顯改善,其中GE低劑量組在造模8、12 h步態評分顯著降低(p<0.05),GE中、高劑量組在造模后直至24 h內步態評分較模型組均顯著降低(p<0.05),48 h后GE高劑量組大鼠步態基本恢復正常,顯示藥物組對大鼠急性痛風性關節炎有緩解作用,并且呈現一定的劑量依賴性,結果見表1。

各組大鼠均于造模后0、6、8、12、24、48 h進行踝關節周徑測定,并計算關節腫脹度,結果如表1所示。由表1可見,與造模前相比,模型組大鼠踝關節周徑均大于正常組(p<0.05),提示造模成功。模型組大鼠關節腫脹度在造模6 h后明顯升高,并于造模12 h后達到最大值(34.7%);與模型組相比,GE中、高劑量組大鼠關節腫脹度均低于模型組大鼠,并且GE高劑量組效果優于GE低劑量組(p<0.05);GE低劑量組與模型組大鼠關節腫脹度無明顯差異。GE中、高劑量組在改善大鼠急性痛風方面均表現良好,隨著時間推移,GE高劑量干預療效優于GE中劑量。

表1 GE對大鼠步態評分及關節腫脹度(%)的影響Table 1 Effect of GE on gait score and joint swelling(%)in

2.2 GE對大鼠關節腫脹抑制率的影響

根據每造模后各時間段腫脹度的計算,代入公式(2)中計算出藥物抑制率(表2所示)。

表2 GE對大鼠關節腫脹抑制率(%)的影響Table 2 Effect of GE on inhibition rate(%)of

通過與模型組大鼠關節腫脹度相比,GE中、高劑量抑制關節腫脹效果顯著(p<0.05),其中GE高劑量抑制大鼠關節腫脹效果極顯著(p<0.01),GE中劑量組抑制率在致炎后6 h達到47.1%,隨著時間推移,GE中劑量組抑制率在8～48 h內保持在20%以上,GE高劑量組抑制率在大鼠致炎后6～48 h內均保持在50%以上,與GE低劑量組相比,呈現一定的劑量依賴性。

2.3 GE對大鼠關節組織病理學的影響

對大鼠滑膜組織染色結果(圖1)顯示,正常組大鼠關節滑膜及周圍組織正常,無炎性細胞浸潤;模型組大鼠關節滑膜表面粗糙不平,可見大量的炎性細胞浸潤,滑膜組織周圍有密集的炎癥細胞分布;給予GE的藥物組大鼠關節滑膜中炎性細胞明顯減少,且中、高劑量干預效果明顯,關節周圍軟組織充血水腫明顯減輕,炎性細胞浸潤明顯減少。

圖1 GE對尿酸鈉誘導的大鼠痛風性關節炎滑膜組織炎癥細胞浸潤的影響(HE,200×)Fig.1 Effect of GE on inflammatory cell infiltration in synovial tissue of rat gouty arthritis induced by sodium urate(HE,200×)

2.4 GE對尿酸鈉誘導的大鼠痛風性關節炎部分炎癥因子的影響

GE對尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎48 h后關節組織中炎癥因子IL-1α、TNF-α、IL-1β水平的影響見圖2。炎癥因子檢測結果顯示,在尿酸鈉造模成功48 h后,與模型組大鼠相比,GE中、高劑量組大鼠關節滑膜組織中IL-1α、TNF-α、IL-1β含量明顯降低,與模型組相比有顯著差異(p<0.05)。

圖2 GE對尿酸鈉誘導的大鼠 痛風性關節炎部分炎癥因子的影響Fig.2 Effect of GE on some inflammatory factors in rat gouty arthritis induced by sodium urate注:與模型組比較:*p<0.05,**p<0.01。

3 結果與討論

機體長期嘌呤代謝異常,引起血尿酸含量升高或體外排出尿酸量減少,從而導致尿酸鹽在體內沉積[16-17]。尿酸鹽能夠誘發體內炎癥因子的產生及釋放,造成炎性細胞浸潤現象,因此機體內尿酸鹽沉積是建立急性痛風性關節炎模型的靶點[18-19]。炎癥因子IL-1α、IL-1β、TNF-α是炎癥反應的直接誘導因素,其中IL-1β起著關鍵作用,它通過抑制關節滑膜組織中酶的表達引起關節軟骨膠原蛋白的變性或損失,引起局部關節紅腫、關節表面溫度升高、病變關節表面發熱、關節疼痛等癥狀[20-23]。根據尿酸鈉注射引起的大鼠急性痛風性關節炎模型,能夠很好地模擬人體痛風性關節炎癥狀,據此考察GE對尿酸鈉誘導的大鼠急性痛風性關節炎的緩解作用。

研究結果表明，GE中、高劑量對大鼠踝關節腫脹程度有顯著緩解作用(p<0.05)。造模成功后,模型組大鼠注射尿酸鈉部位關節產生明顯腫脹,與正常組大鼠相比有顯著差異(p<0.05),在造模12 h后模型組大鼠關節腫脹度達到最高峰34.7%,而GE中、高劑量組大鼠踝關節腫脹度明顯降低,統計學結果顯示其與模型組大鼠相比有顯著差異(p<0.05)。GE中、高劑量對痛風性關節炎大鼠的關節腫脹有較明顯的改善作用,證明GE對急性通風性關節炎有積極作用,其中GE中劑量組大鼠在造模12 h后的關節腫脹度降到25%,GE高劑量組大鼠關節腫脹度則降至20%以下。步態分析及病理實驗結果顯示GE中、高劑量對大鼠急性痛風性關節炎的改善作用均顯著(p<0.05);模型組大鼠關節滑膜組織中炎癥細胞浸潤明顯,而GE中、高劑量組大鼠關節滑膜組織中炎性細胞浸潤減少。炎癥因子檢測結果顯示,GE中、高劑量大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-1α含量較模型組顯著降低(p<0.05),GE中、高劑量組能夠顯著降低痛風關節炎大鼠體內的炎癥因子水平,從而緩解痛風關節炎的癥狀。GE在大鼠急性痛風性關節炎發病時表現出積極的影響作用,并呈現出一定的劑量依賴性,本研究證實GE在抗急性痛風性關節炎方面有緩解作用,但其作用機制尚不明確,有待進一步研究。