兩步法制備菜粕肽及提高蛋白溶解度工藝

帖余，劉軍，李麗*，王景峰，王國強，趙琦鍇，周鵬松

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢，643000)2(樂山恒峰華邦生物科技有限公司，四川 樂山，614000)

菜粕是菜籽經榨油后的副產物，其中含粗蛋白質量分數為35%～42%，氨基酸含量豐富，是一種重要的植物蛋白資源[1-2]。但由于含有多種抗營養因子且蛋白品質不佳，降低了其在食品和飼料行業中的應用價值[3-4]。為了改善菜粕的品質，國內外許多學者已對其進行了大量研究，雖然早期的物理法、化學法能有效降低有毒物質，但存在試劑殘留、營養損失等問題[5-6]。近年來，微生物發酵法因具有經濟高效、重現性好等優點受到廣泛關注[7]。

目前大多數提高菜粕營養價值的研究僅側重于通過微生物發酵脫毒，而對蛋白品質提升改良關注相對較少。即使菜粕中抗營養因子能被有效的降解，但其中大部分蛋白仍為大分子蛋白，且小肽含量少、蛋白溶解度低[8]，因此其品質不如豆粕魚粉等蛋白原料，仍然導致其使用價值受到限制。小肽是由2～20個氨基酸組成的寡肽[9]，不僅具有易分解、吸收的特點，更具有抗氧化性等功能[10-11]。蛋白溶解性是衡量蛋白質食品加工屬性的重要指標，是具有其他優良功能性質的先決條件[12]。因此，提高菜粕中小肽含量及蛋白溶解度將有利于其在食品、飼料行業的應用。基于霉菌在發酵過程中會分泌多種蛋白酶系的特點[13-14]，本實驗主要先通過霉菌固態發酵菜粕產酶，后在發酵的基礎上利用酶解進一步處理菜粕提高小肽含量和蛋白溶解度。同時考察不同條件對菜粕中小肽含量和蛋白溶解度的影響，為進一步提高菜粕應用價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉(H1, H2, H3, H4)、米曲霉(M1, M2)、白地霉(J1)、產朊假絲酵母(J2)、熱帶假絲酵母(J3)、解脂假絲酵母(J4, J5):均購于中國工業菌種保藏中心(CICC)。

1.1.2 原料

菜粕、麩皮:由樂山恒峰華邦科技有限公司提供。菜粕中含粗蛋白，小肽質量分數為38%、2.86%，蛋白質溶解度為 10.17%，水分含量為 10.09%(質量分數)；麩皮中水分含量為9.87%(質量分數)。

1.1.3 培養基

保藏培養基：黑曲霉、米曲霉采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，酵母菌采用麥芽汁瓊脂培養基。

霉菌麩皮種子培養基：麩皮∶水=2∶1 (g∶mL)；酵母麩皮種子培養基：麩皮∶水=6∶5 (g∶mL)；混勻后分別取30 g裝入500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

發酵培養基：菜粕∶麩皮∶水=7∶3∶15 (g∶g∶mL)；混勻取 60 g裝于500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

T-114型分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；T6紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；QYC-2102C型恒溫培養搖床，上海福馬實驗設備有限公司；MF 80BSH-2型霉菌培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；LS-75HD立式高壓蒸汽滅菌器，江陰濱江醫療設備有限公司；SW-CJ-2F 型超級潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；K9840自動凱氏定氮儀，山東海能科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子制備

將保藏的菌種勾取5～7環分別接種于種子培養基中，霉菌30 ℃恒溫培養72 h，酵母30 ℃恒溫培養48 h。

1.3.2 固態發酵

將霉菌和酵母的麩皮種子分別按1∶20(g∶g)接種于發酵培養基中，混勻，30 ℃發酵36 h；之后取30 g發酵菜粕于70 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩網測定指標。

1.3.3 酶解

取固態發酵結束后的30 g發酵菜粕裝入自封袋，45 ℃密閉恒溫酶解24 h；之后將菜粕于70 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩網測定指標。

1.3.4 不同工藝條件對小肽含量和蛋白溶解度的影響

固態發酵階段，分別考察不同發酵時間(12、24、36、48、60、72 h)對小肽和蛋白溶解度變化影響；酶解階段，分別考察不同酶解時間(6、12、18、24、30、36 h)、酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對小肽和蛋白溶解度變化影響。

1.3.5 理化指標測定

小肽根據GB/T 22492—2008測定[15]；蛋白溶解度根據文獻[16]測定；酸性蛋白酶活根據文獻[17]測定；蛋白分子質量分布采用Tricine-SDS-PAGE測定[18]。

1.3.6 數據分析

采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，并用Duncan檢驗法進行多重比較，試驗結果采用平均值±標準誤差表示，以P<0.05作為差異性顯著判斷標準。采用Origin 2018 進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 固態發酵

所有單一試驗菌株發酵36 h后對小肽含量和蛋白溶解度均有一定影響(圖1)。結果表明，經霉菌發酵后，小肽含量及蛋白溶解度顯著提高(P<0.05)。經H4發酵后，菜粕中小肽質量分數及蛋白溶解度均最高，分別為7.86%、25.23%，相比于未發酵菜粕分別提高了148.08%和174.83%。這與吳正可等[19]通過多菌種發酵菜粕將小肽含量從0.84%提高至2.62%的研究結果相似。

圖1 單菌固態發酵對小肽含量及蛋白溶解度的影響Fig.1 Changes of small peptide content and protein solubility of rapeseed meal after fermentation

2.2 酶解

圖2表明，進一步將霉菌發酵的菜粕酶解，小肽含量和蛋白溶解度在發酵后的基礎上進一步提高。

圖2 酶解發酵菜粕后小肽含量及蛋白溶解度變化Fig.2 Changes of small peptide content and protein solubility of rapeseed meal after enzymatic hydrolysis

尤其經H4發酵酶解后，小肽質量分數及蛋白溶解度提高到13.05%和44.37%。相比于單步固態發酵分別提高了66.03%和75.86%，相比于空白，小肽含量提高了3.6倍。這與姚曉紅等[20]采用外加中性蛋白酶與微生物協同固態發酵菜粕96 h后小肽含量提高了3.7倍的研究結果相似。在發酵過程中，蛋白酶將菜粕中大分子蛋白分解為小分子肽，同時由于菌體的生長代謝，分解培養基中部分碳水化合物，最終導致干物質損失，因此使得小肽含量提高[21]。當發酵結束后，將菜粕置于適當溫度下進行酶解，H4分泌的相關的酶系進一步將大分子蛋白降解為小分子肽，因此使得小肽含量及蛋白溶解度進一步顯著提高。將酵母菌發酵的菜粕進一步酶解后，相比單步固態發酵，小肽含量及蛋白溶解度提高不明顯，可能由于酵母菌分泌蛋白酶系能力較弱導致，因此推測此過程中小肽含量增加的主要原因是菜粕中碳水化合物被消耗而使得小肽含量相對富集。由于菜粕經H4發酵酶解后，小肽含量及蛋白溶解度最高，因此選擇H4用于后續試驗研究最佳酶解條件。

2.3 不同發酵酶解時間對小肽含量、蛋白溶解度的影響

經H4發酵不同時間后酶解24 h的結果如圖3所示。發酵48 h后酶解，小肽質量分數及蛋白溶解度最高，分別為13.96%，42.98%。在發酵48 h前酶解，小肽含量及蛋白溶解度隨蛋白酶活增加而增加，但當發酵超過48 h后酶解，小肽含量和蛋白溶解度不隨酶活增加而增加。結果表明，在酶解過程中，小肽含量及蛋白溶解度與蛋白酶活變化趨勢不同，可能存在其他酶系影響小肽含量及蛋白溶解度。此結果與ZHAO等[22]的研究結果相似，在酶解豆粕生產氨基酸過程中，氨基酸含量不完全隨中性蛋白酶的變化趨勢變化。

圖3 發酵時間對小肽含量、蛋白溶解度、蛋白酶活的影響Fig.3 Effect of fermentation time on small peptide content, protein solubility and protease activity

圖4表明，通過固態發酵后，菜粕中含小肽質量分數及蛋白溶解度分別為7.74%、27.40%，再經過45 ℃酶解30 h后，小肽質量分數及蛋白溶解度分別提高至14.12%、 44.95%，相比于單步固態發酵分別提高了82.43%和64.05%。同時結果也表明，酶解前12 h， 小肽含量及蛋白溶解度增長較快，12 h后增長速率下降，可能是酶解12 h后蛋白酶酶活力大幅下降所致；當經過30 h酶解后，小肽含量及蛋白溶解度不隨酶解時間增加而改變(P>0.05)，可能是酶解后期底物濃度不足和蛋白酶活較低導致。因此，選擇48、30 h分別為最佳發酵、酶解時間。

圖4 酶解時間對小肽含量、蛋白溶解度、蛋白酶活的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on small peptide content, protein solubility and protease activity

2.4 酶解溫度對小肽含量、蛋白溶解度的影響

如圖5所示， 45～50 ℃為最適酶解溫度范圍，當酶解溫度超過50 ℃時，小肽含量及蛋白溶解度明顯下降(P<0.05)。這可能因為H4產生的蛋白酶最適作用溫度為45～50 ℃，當酶解溫度超過酶最適溫度范圍時，酶穩定性下降，易在酶解過程中失活，最終導致酶解后小肽含量及蛋白溶解度低。由于發酵的菜粕在45～50 ℃酶解后，小肽含量及蛋白溶解度沒有顯著變化(P>0.05)，同時為降低酶解能耗，選擇45 ℃作為最佳酶解溫度。

圖5 酶解溫度小肽含量、蛋白溶解度、蛋白酶活的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on small peptide content, protein solubility and protease activity

2.5 發酵酶解后菜粕蛋白質分子組成變化

如圖6所示，未發酵的菜粕蛋白質分子質量在4.6～42 kDa分布較少，經過H4發酵后，10～42 kDa的蛋白質含量增加，少量10 kDa的蛋白質被分解。經過酶解后，4.6～97.2 kDa的蛋白質含量明顯減少，特別是10 kDa的蛋白質幾乎完全降解。由于菜粕中的蛋白質分子質量主要約為300 kDa[23]，經H4發酵后，其中部分大分子蛋白被H4或分泌的酶分解利用，使得42～97.2 kDa的蛋白質含量增加，且部分10 kDa的蛋白質被分解為小分子蛋白。結果表明，經過酶解后大部分10～97.2 kDa的蛋白質進一步被相關酶系分解為小分子蛋白(<4.6 kDa)，使得小肽含量及蛋白溶解度在酶解后顯著增加。

M1、M2-蛋白分子質量標準圖6 菜籽粕發酵、酶解后蛋白分子組成變化Fig.6 Changes of protein molecular composition of fermented and enzymatic hydrolysis rapeseed meal

3 結論

通過不同工藝條件比較，確定最優固態發酵時間、酶解時間和酶解溫度分別為48、30 h和45 ℃。與空白對照相比，經過發酵酶解兩步法處理的菜粕，其小肽含量和蛋白溶解度分別提高了393.71%和341.99%；與單步固態發酵相比，其小肽質量分數和蛋白溶解度分別提高了79.64%和78.16%。酶解后，菜粕中大部分大分子蛋白降解為小分子蛋白(<4.6 kDa)，有效改善了菜粕蛋白的品質，提高了菜粕的應用價值。