濕態和半干態泡菜發酵過程中水分活度對揮發性成分的影響及差異解析

汪冬冬，陳功,2，李恒,2，唐垚，張偉，朱翔，李梅，張其圣,2*

1(四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山，620000)2(四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都，611130)3(眉山市產品質量監督檢驗所，四川 眉山，620000)

泡菜是一種起源于中國周朝的傳統發酵蔬菜，傳承千年，深受各地消費者喜愛。其是利用本土微生物自然發酵而成，受溫度、鹽度、pH、工藝等因素的影響，呈現出多樣化，風味迥異的特點[1]。根據水分的差異，泡菜可以分為濕態發酵泡菜(四川泡菜、東北酸菜等)和半干態發酵泡菜(宜賓芽菜、川/津冬菜等)[2]。由此看出，水分是區分泡菜工藝種類的一個最重要因素，其對泡菜發酵菌群、品質和風味等起著至關重要的作用。

風味是泡菜的靈魂，是評價泡菜品質的重要指標。不同發酵工藝的泡菜風味成分已有一些報道。如濕態發酵泡菜研究中，XIAO等[3]采用GC-MS和GC-O發現泡辣椒含有67種揮發性化合物，結合多重分析發現，主成分為乙酸、2-乙基苯酚、L-芳樟醇、十三烷、丁酸丁酯和3-蒈烯。徐丹萍等[4]研究發現，四川泡蘿卜發酵以后主體風味為酯類，酯類主要為1-異硫代氰酸丁酯、異硫氰酸乙酯，相對含量在10%以上。侯曉艷等[5]采用接種發酵和自然發酵對比發現，泡蘿卜中揮發性風味物質主要是烯類、酯類和酮類。KANG等[6]和CHA等[7]研究發現，韓國泡菜的主要風味物質為二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等含硫化合物。半干態發酵泡菜研究中，YAO等[8]采用GC-MS和電子鼻研究不同腌漬年限冬菜的揮發性成分，結合主成分可以清楚區分冬菜樣品。左勇等[9]采用GC-MS結合主成分分析發現影響芽菜的主要風味物質為順-4-(1-甲基乙基)環己醇、2-十一酮、5-甲基-2-異丙基-3-環已烯-1-酮、對異丙基環己醇等12種。石磊[10]采用GC-MS在自然發酵冬菜中檢出較高含量的二甲基二硫醚、二烯基甲基二硫醚、硫茚等含硫類物質。劉大群等[11]使用電子鼻和GC-MS從風脫水和鹽脫水蕭山蘿卜干中檢測出58和35種揮發性香氣物質，風脫水蘿卜干揮發性香氣成分種類高于鹽脫水蘿卜干。

因此，濕態發酵和半干態發酵泡菜風味迥異，而目前少有研究報道兩種工藝在相同實驗條件下揮發性成分的差異。本研究利用AW的差異模擬傳統典型濕態和半干態泡菜，基于GC-MS代謝途徑探討濕態和半干態蘿卜泡菜發酵過程中水分活度對風味的影響，確定各主體風味成分及其差異，為泡菜加工和品質調控提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮長蘿卜、食鹽，購于眉山當地農貿市場；MRS培養基，北京奧博星生物技術有限公司；其他均為國產分析純試劑。

1.2 實驗儀器

GC-MSQP2010氣相色譜質譜聯用儀，日本島津儀器公司；DB-WAX(60 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱，美國安捷倫公司；SPME裝置(50/30 μm, DVB/CAR/PDMS萃取頭)頂空進樣瓶(15 mL)，美國Supelco公司；HD-3A智能水分活度檢測量儀，無錫市華科儀器儀表有限公司；JN-400i無菌均質器，寧波江南儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 泡菜制作及取樣

濕態泡菜(P)：將蘿卜洗干凈晾干切成長寬高為2～4 cm的塊狀，按菜和滅菌鹽水質量比1∶1進行25 ℃發酵，每壇5 L，裝滿至壇沿處，平衡后加入3%食鹽(質量分數)，壇沿加水密封，平行2壇。半干態泡菜(Y)：將蘿卜洗干凈晾干切成長6～8 cm，寬 1 cm 的條狀，曬干后用水清洗干凈后再擰干除去多余水分，裝壇發酵，壓緊至壇沿處，控制平衡后加入7%食鹽(質量分數)，壇沿加水密封，恒溫25 ℃發酵，每壇2 kg，平行2壇。取發酵0、3、6、10、20、30 d的蘿卜固體樣品進行分析。

1.3.2 泡菜微生物數量和理化特性變化

將25 g泡菜固體加入到225 g含0.85%(質量分數)NaCl無菌生理鹽水的均質袋中，用拍擊式均質器拍打2 min，勻漿后進行1∶10梯度稀釋，采用傾注法將制成的樣品菌懸液接入MRS培養基中，37 ℃培養48 h后選取菌落數在30～300的平板記錄菌落數。平行重復3次，取其平均值，以未接菌株的培養基作為空白對照。

1.3.3 總酸和水分活度變化

總酸含量采用酸堿滴定法，含量以乳酸計。取粉碎混勻后的樣品約20 g，置于恒重后的康氏皿中，放置于水分活度測試儀器中進行測試，水分活度儀常溫下測定30 min結束。

1.3.4 揮發性成分分析

(1)樣品處理和檢測條件：樣品的前處理參照BLEVE等[12]的方法微改，取搗碎后的泡菜樣品2 g于15 mL頂空進樣瓶中，加入2 g NaCl混勻后密封置于40℃恒溫槽中水浴加熱平衡30 min，將老化后的SPME萃取頭插入到頂空進樣瓶中吸附30 min，然后拔出萃取頭插入到GC-MS氣相色譜進樣口，于250 ℃條件下解析5 min，每個樣品平行2次。GC條件：不分流進樣模式；進樣溫度：40 ℃；進樣口溫度：250 ℃；總流量：50 mL/min；進樣時間：1 min；控制流量方式：線速度；載氣：He；載氣流量：1.2 mL/min。柱溫程序升溫參考TRIPATHI等[13]和汪冬冬等[14]的方法并作優化：40℃(0 min)以16 ℃/min到75 ℃(保持0 min)，以2 ℃/min到94 ℃(保持1 min)，以2 ℃/min到110 ℃(保持1 min)，以3 ℃/min到122 ℃(保持1 min)， 以2 ℃/min到130 ℃(保持1 min)，以2 ℃/min到136 ℃(保持1 min)，以2 ℃/min到143 ℃(保持1 min)，以6 ℃/min到200 ℃(保持5 min)。MS條件：電子離子源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；檢測器電壓：0.1 kV；Scan采集方式，掃描質量范圍：m/z35.00～350.00 amu。

(2)定性和定量分析：由GC-MS得到的譜圖，經計算機在(NIST.11 library)標準譜庫進行檢索匹配，選取相似度(SI)>80(最大值為100)的物質進行分析。并結合已發表的文獻報道，確定出揮發性風味成分。采用氣相色譜峰面積歸一化法定量確定出不同泡菜樣品中各化合物的相對含量。

1.3.5 數據處理和多元分析

本研究通過Excel 2007軟件進行實驗數據的匯總處理，總離子強度數據和特征揮發性成分變化數據導入Origin 9.1中作圖分析。將同時在3個以上蘿卜泡菜樣品中均檢測到的揮發性成分導入SIMCA 14.1統計軟件中進行主成分、層次聚類和偏最小二乘法判別分析方法[15]。層次聚類(hierchical clutering，HCA)按照樣本數大小分類，使用離差平方和算法。主成分分析(principal component analysis，PCA)圖中橢圓為Hotelling的T2區域，表示建模變異的95%置信區間。PCA模型的質量由R2(數據的方差)和Q2值(模型的預測)表示。進行200 次迭代置換測試以避免模型過度擬合，得到偏最小二乘法判別分析(partial least squanres disscrimination analysis，PLS-DA)模型后，分析變量重要性得分值(variable importance)> 1.2且P<0.05的具有可變重要性的峰，這些物質被認為是造成差異的原因。

2 結果與分析

2.1 微生物數量和理化特性變化

圖1-A所示，濕態泡菜在發酵過程中，AW相對穩定，處于0.98附近，半干態泡菜AW整體為0.81～0.84，在發酵3 d處有一定波動。BEUCHAT[16]認為AW決定微生物生長所需要水的下限值，大多數細菌在水分活度0.91以下停止生長，大多數霉菌在水分活度0.8 以下停止生長。因此，濕態發酵泡菜可能更有利于微生物的生長，這對泡菜揮發性成分有一定影響。

酸度是泡菜重要的理化參數，不僅顯示泡菜品質，而且還顯示泡菜微生物生長情況[17-18]。水分影響泡菜乳酸菌代謝產物的生成，導致不同水分下泡菜總酸不同。濕態和半干態泡菜總酸含量變化如圖1-B，隨著發酵的進行，濕態泡菜總酸含量呈先上升后下降的趨勢。一般認為，當泡菜酸度升高到0.30 g/100 g，泡菜就基本成熟[17]，說明濕態泡菜發酵6 d接近成熟，發酵20 d時酸度達到0.66 g/100 g。發酵后期總酸逐漸下降，這可能與乳酸菌數量降低和乳酸被其他微生物利用有關。半干態泡菜的總酸含量呈現緩慢上升至穩定的趨勢，含量遠高于濕態泡菜，這可能是原料經過脫水，原料中的有機酸出現富集的原因。

泡菜發酵過程中伴隨著微生物不斷演替和數量變化，來自環境的微生物附著在蔬菜表面，發酵過程中利用蔬菜營養物質迅速繁殖。泡菜發酵主要是細菌中乳酸菌主導發酵，乳酸菌數量的變化反映泡菜發酵的程度[19]。濕態和半干態發酵泡菜乳酸菌數量變化如圖1-C，濕態發酵泡菜乳酸菌數量呈現先上升后降低的趨勢，發酵初期乳酸菌快速生長，發酵到3 d時達到峰值1.5×107CFU/g，發酵10 d時開始下降，這與發酵后期整體環境酸度高、營養物質被大量消耗有關。半干態發酵泡菜乳酸菌數量呈下降的趨勢，表明低AW有利于抑制微生物生長，防止食品腐敗。這也清晰地說明濕態相比半干態泡菜更利于乳酸菌生長。

A-AW；B-總酸；C-乳酸菌數量圖1 泡菜發酵過程中AW、總酸和乳酸菌數量動態變化Fig.1 Dynamic changes of AW, total acid and lactic acid bacteria in paocai fermentation process注：P，濕態泡菜發酵，Y，半干態泡菜發酵。下同。

2.2 發酵過程中揮發性成分

基于GC-MS代謝途徑分析濕態和半干態發酵泡菜中揮發性成分，得到總離子色譜圖，如圖2。濕態泡菜和半干態泡菜離子強度大的物質出峰時間類似，但強度差異較大，表明有共同揮發性物質，但含量存在差異。濕態泡菜原料在50 min附近的離子強度隨著發酵進行逐漸減弱；而半干態發酵泡菜在20 min附近的離子強度隨著發酵進行逐漸增強。說明水分的差異影響了初始風味成分，且差異性明顯，隨著發酵的進行，特征性風味物質逐漸累積或被降解。

a-濕態泡菜；b-半干態泡菜0P、3P、6P、10P、30P為濕態發酵0、3、6、10、30 d；0Y、3Y、6Y、10Y、30Y為半干態發酵0、3、6、10、30 d(A、B為平行樣)圖2 泡菜揮發性成分GC-MS總離子色譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in paocai

通過GC-MS得到濕態和半干態發酵30 d揮發性成分共48 種，其中濕態發酵泡菜41 種，半干態發酵泡菜33 種，結果如表1。這些揮發性化合物中包括含硫化合物(13 種)、酸類(6種)、醇類(11 種)、烴類(8種)、醛類(4種)、酮類(2種)和其他類化合物(4種)。濕態發酵泡菜主要為含硫化合物和醇類，

表1 濕態和半干態泡菜發酵過程中揮發性風味成分Table 1 Volatile flavor components in the fermentation process of wet and semi-drypaocai

注：“-”表示未檢測出，“P”表示濕態泡菜發酵，“Y”表示半干態泡菜發酵，“0～30”表示發酵時間,d。

半干態發酵主要為含硫化合物。通過發酵前后對比發現，一些揮發性化合物主要是經過發酵產生的，包括異硫脲硫酸甲酯、L-乳酸、乙酸、己酸、辛酸、乙醇、2-癸烯-1-醇、甲基庚烯酮、3-乙基苯酚等成分；另一部分揮發性化合物如甲硫醇、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、4-異硫氰酸基-1-(甲基亞磺酰基)-1-丁烯、異硫氰酸丙酯、庚基氫過氧化物等成分來自原料自身，其中二甲基二硫醚等在半干態發酵過程中逐漸累積。

2.3 發酵過程中揮發性成分變化

GC-MS用于監測泡菜發酵過程中的揮發性成分變化，使用PCA得分圖表示濕態和半干態泡菜發酵30 d篩選的物質成分的變化，如圖3-A。其中R2=0.638，Q2=0.342，兩種工藝泡菜特征變量63.7%的累積差異被描述，包含45.7%PC1和18.0%PC2。同一95%置信區域顯示出濕態和半干態發酵泡菜得到了明顯的區分，根據發酵周期，濕態發酵泡菜樣品點逐漸從第一象限向第四象限移動，表明發酵過程中連續的揮發性成分變化，發酵前后差異大。另一組為半干態發酵泡菜，分布在第二、三象限，但分布較集中，表明發酵過程中揮發性成分較穩定，變化緩慢。

兩種工藝發酵泡菜與揮發性風味成分在主成分上分布得到biplot圖，顯示出兩種工藝泡菜揮發性成分種類和相對含量的共性和個性，如圖3-B。揮發性成分距離樣品位置越近，表明其影響越大。在濕態泡菜中，發酵在3～10 d時，特征性成分為2-壬烯-1-醇、2-癸烯-1-醇、3-十一烯、己酸、2-戊酮酸、辛酸等，發酵在20～30 d時，主要揮發性成分為二甲基二硫醚、苯乙醇、異硫脲硫酸甲酯、2-癸醇、2-十一烷醇、乙醇、3-乙基苯酚等。半干態發酵泡菜風味成分變化較小，主要揮發性成分為4-異硫氰酸基-1-(甲基亞磺酰基)-1-丁烯、4-甲基十三烷、苯乙烯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2,3-丁二醇、5-甲硫基戊腈、4-異硫代氰酸甲基戊酯和2-甲基-4-丙基氧雜環丁烷等。

為更好地顯示水分活度對兩種工藝泡菜揮發性成分的差異性，采用HCA分析，基于揮發性成分和樣本數計算，按照樣本數大小分類，如圖3-C。在樣本數為160～600時，可以將所有樣品分為兩類，其中一類為濕態發酵3～30 d樣品，另一類為0 d的新鮮蔬菜原料和所有的半干態發酵泡菜樣品。表明水分活度的差異使兩種工藝發酵泡菜揮發性風味成分明顯區分，說明該方法在聚類識別中的穩定性。濕態發酵的樣品大小差異大，而半干態發酵的樣品差異不明顯，表明半干態泡菜保留了大量原料自身攜帶的揮發性成分。

A- PCA得分圖； B-biplot；C-HCA分析圖3 濕態和半干態泡菜揮發性成分分析Fig.3 Analysis of volatile components in wet and semi-dry paocai

2.4 不同水分活度發酵泡菜揮發性成分差異性

為了將泡菜樣品之間最大化分離，去除未控制變量對數據分析的影響，量化特征揮發性成分造成組分差異的程度，應用了監督模式識別方法PLS-DA，如圖4-A。PLS-DA得分圖顯示泡菜樣品之間明顯分離。模型解釋率R2X、R2Y和模型預測能力Q2值分別為0.569，0.986和0.876，其中R2Y和Q2都>0.5，說明模型質量較好[20]。根據PCA模型顯示所有泡菜樣品同一95%置信區域得到了明顯的區分。濕態發酵泡菜樣品點處在第二、三象限移動，但0 d的泡菜原料與其他樣品分布距離遠，表明發酵后樣品風味差異大。半干態發酵泡菜分布在第一、四象限，但分布較集中，表明發酵過程中揮發性成分較穩定，變化緩慢。兩種工藝泡菜的差異是由于AW影響了泡菜原料的風味，同時發酵過程中細菌群落結構差異大也是非常重要的原因。

經過200次置換測試以驗證PLS-DA模型，通過該測試發現，Q2和R2值高于其原始值(最右邊>左邊)，證明了該模型的適用性和有效性，如圖4-B。

A-PLS-DA得分圖； B-PLS-DA模型置換測試圖4 泡菜揮發性成分PLS-DA圖及置換檢驗圖Fig.4 PLS-DA diagram and replacement test diagram of volatile components in paocai

為了確定差異性的揮發性成分，通過PLS-DA模型篩選對揮發性物質差異具有貢獻的標志物，篩選出重要度(VIP>1.2)以及t檢驗(P<0.05)的特征性揮發性風味成分有8種，重要性由大到小為二甲基三

硫醚、1-異硫氰酸戊酯、5-甲硫基戊腈、5-甲硫基-2-戊烯-4-炔醇、乙酸、2，3-丁二醇、庚基氫過氧化物和甲氧基苯肟。

8種特征性揮發性風味成分中1-異硫氰酸戊酯、5-甲硫基-2-戊烯-4-炔醇和2,3-丁二醇為半干態泡菜特有的差異性物質，可作為濕態和半干態發酵屬性區分物質。1-異硫氰酸戊酯具有辛辣味，閾值低，為十字花科植物中的硫甙物質降解產物[21-22]，說明在鹽漬過程中蘿卜組織因鹽漬、低水分等原因而破壞，芥子酶與芥子苷接觸而發生酶解。而在濕態發酵中未檢測出，表明產酸發酵能降解辛辣味，使泡菜風味更柔和。甲氧基苯肟為兩種工藝共有物質，在濕態發酵中先增加后減少，在半干態中呈現逐漸減少的趨勢，該物質在其他植物、羅非魚中常被檢測出[23-25]，可能為蘿卜原料自身攜帶的物質成分；5-甲硫基戊腈在所有樣品中除0 d外都有發現，該物質為蘿卜原料中的硫甙物質降解產物[21]。

8種特征性揮發性風味成分相對含量>2%的有二甲基三硫醚、乙酸、2,3-丁二醇和庚基氫過氧化物，對其在濕態和半干態泡菜中的動態變化描述如圖5。

A-二甲基三硫醚； B-乙酸； C-2,3-丁二醇； D-庚基氫過氧化物圖5 濕態和半干態泡菜發酵過程中差異性標志物豐度變化Fig.5 Changes in abundance of differential markers during fermentation of wet and semi-dry paocai

二甲基三硫醚是半干態中主要揮發性物質，相對含量隨發酵時間逐漸增加，30 d時達到76%，在濕態發酵中呈現先增加后減少的趨勢。二甲基三硫醚常被報道是四川泡菜[26-27]、韓國泡菜[6-7]等主要風味物質，其閾值低，呈蔥香味[26]。乙酸和庚基氫過氧化物為兩種工藝發酵共有物質，其中乙酸在濕態中含量相對較高，濕態中發酵2 d出現乙酸，隨著發酵進行先增加后穩定的過程，在半干態發酵中含量逐漸減少。乙酸是泡菜中重要的揮發性有機酸，其風味刺激，適量的乙酸對泡菜風味具有提升作用[28]，如產生乙酸乙酯等香味物質。乙酸主要為泡菜發酵前期出現的醋酸菌或腸膜明串珠菌等微生物代謝產生[29]，也有報道為大腸桿菌等分解葡萄糖產酸的代謝物[30]，這與大量報道泡菜發酵前期出現豐度較高的腸桿菌科細菌相一致[31-32]。發酵后期不耐酸微生物的減少，乙酸含量出現穩定和下降，可能與醇類物質發生酯化反應或形成其他成分有關。庚基氫過氧化物在濕態發酵中含量逐漸增加，而在半干態中含量逐漸減少，氫過氧化物在其他食品中常作為脂肪酶促反應的產物[33]。2,3-丁二醇在半干態發酵中含量逐漸減少，其是酒[34]、發酵豆制品[35]等中常見風味成分，可改善食品風味，在工業中作為香精物料。

有些結論與本研究一致，但也有報道存在明顯的差異，這主要是其風味物質還受泡菜發酵原輔料、鹽度和檢測條件等因素影響，研究結果難以相互比較。本文泡菜采用理想的狀態(恒溫、不含香辛料)進行分析，但現實的泡菜往往是一個復雜的環境，要進一步弄清楚泡菜風味產生機理、風味協同和釋放關系等，才更有利于泡菜風味物質的調控。

3 結論

本研究采用HS-SPME-GC-MS結合多元統計分析濕態和半干態泡菜發酵過程中揮發性成分的變化及其差異，結果表明，濕態和半干態發酵工藝泡菜AW差異明顯，濕態泡菜更有利于乳酸菌快速生長和總酸的形成。濕態泡菜揮發性成分主要為發酵過程中產生的含硫化合物和醇類，半干態泡菜揮發性成分主要為原料自身的含硫化合物。二甲基三硫醚、1-異硫氰酸戊酯、5-甲硫基戊腈、5-甲硫基-2-戊烯-4-炔醇、乙酸、2,3-丁二醇、庚基氫過氧化物和甲氧基苯肟為濕態和半干態泡菜差異性標志物，其可以用于區分濕態和半干態發酵泡菜工藝和發酵狀態。然而，泡菜需要更詳細的研究來理解泡菜感官特征、微生物群落和揮發性風味物質的關系，才能有助于調控泡菜品質。