紅茶菌在綠茶液中培養(yǎng)條件優(yōu)化

馬燕 黃海珠 金樁 易永紅 陳俊波 謝式云

摘要：該研究將分離篩選所得的酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌和短桿乳酸菌復(fù)配得到紅茶菌，以綠茶基液為發(fā)酵液，對紅茶菌中3株菌接種量、配比、時間、溫度、加糖量和裝液量培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)合pH值、菌膜生成情況及菌液總活菌數(shù)，得出最佳接種比例分別為酵母菌1%、產(chǎn)膜醋酸菌3%、乳酸菌1%，即總接種量5%，最適培養(yǎng)溫度為30°C，最佳培養(yǎng)時間為8d，綠茶基液最適加糖量8%，裝液量60%。

關(guān)鍵詞：紅茶菌;優(yōu)化;pH值;菌膜;總活菌數(shù)

中圖分類號：TS275

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.22.001

0引言

紅茶菌是以茶葉、糖和水為發(fā)酵基液，由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等多種有益微生物所組成的共生體共同發(fā)酵而成[1-2]。紅茶菌雖在我國民間流傳已久，但對紅茶菌菌種及其相互作用方面的基礎(chǔ)研究還不夠系統(tǒng)[3]，在紅茶菌菌種培養(yǎng)過程中，由于紅茶菌來源不同，篩選純化的單一菌種復(fù)合配伍后的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基液成分構(gòu)成等都有待進(jìn)一步探討[4-6]。本研究主要將分離篩選得到酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌和短桿乳酸菌進(jìn)行復(fù)配培養(yǎng)得到共生體，通過將綠茶液中的培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到優(yōu)質(zhì)的紅茶菌，為下一步生產(chǎn)中草藥紅茶菌制劑提供紅茶菌母種，并用于豬場防控疫病及提高不同豬群的生產(chǎn)性能。

1材料與方法

1.1菌種來源

由羅牛山股份有限公司博士后科研工作站實(shí)驗(yàn)室，從不同來源（山東威海及廣東湛江）購買的紅茶菌產(chǎn)品中分離篩選得到的優(yōu)勢微生物酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌和短桿乳酸菌作為試驗(yàn)菌種。

1.2儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（LRH-150上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;pH計(jì)（FE28梅特勒一多利儀器（上海）有限公司）;3M菌落總數(shù)測試片（6406明尼蘇達(dá)礦業(yè)制造（上海）國際貿(mào)易有限公司）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（101A-2B型上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;生物潔凈工作臺（SA-960-2型，上海上凈凈化設(shè)備有限公司）;電子天平（BL6100北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.3測定方法

pH值測定：采用PH酸度計(jì)直接測定;

總活菌數(shù)測定：采用3M試紙計(jì)數(shù);

菌膜：觀察膜光滑程度，采用游標(biāo)卡尺測量菌膜厚度。

1.4菌種培養(yǎng)

酵母菌培養(yǎng)基：葡萄糖20g，酵母菌提取物10g，蛋白胨20g，硫酸鎂0.5g和磷酸二氫鉀0.3g，瓊脂20g，1L蒸餾水。加熱使所有成分溶解，冷卻后用6mol/L的H°CL將pH值調(diào)至4.2，分裝，121°C濕熱滅菌20min，斜面接種，30°C培養(yǎng)24h，置冰箱中保藏備用。擴(kuò)大培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)基（上述培養(yǎng)基不加瓊脂），接種30°C培養(yǎng)41h，酵母菌數(shù)量在108°Cfu/mL以上，置冰箱中冷藏備用。

產(chǎn)膜醋酸菌培養(yǎng)基：葡萄糖20g，酵母浸膏3g，蛋白胨2g，碳酸鈣10g，瓊脂20g，pH值6.8，蒸餾水1000mL，劃平板接種，30°C培養(yǎng)3d，置冰箱冷藏備用。擴(kuò)大培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)基（上述培養(yǎng)基不加碳酸鈣和瓊脂），滅菌后冷卻至50°C左右加入無水乙醇2%，接種30°C培養(yǎng)7d，其培養(yǎng)菌液pH值達(dá)到3.0以下，總活菌數(shù)達(dá)到104°Cfu/mL以上，置冰箱中冷藏備用。

短桿乳酸菌培養(yǎng)基[7]：蛋白胨12g，酵母提取物5g，牛肉膏12g，葡萄糖16g，乙酸鈉5g，檸檬酸胺2.15g，吐溫80mL，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.03g，磷酸氫二鉀2g，瓊脂17g，水1000mL，pH值5.5。擺斜面接種，溫度為35°C培養(yǎng)24h，置冰箱冷藏備用。擴(kuò)大培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)（上述培養(yǎng)基不加瓊脂），培養(yǎng)條件相同，分光光度計(jì)測定其菌液OD值增加0.9以上，菌數(shù)達(dá)到1010cfu/mL以上，冰箱保藏備用。

1.5培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)

培養(yǎng)條件優(yōu)化：制備綠茶發(fā)酵基液正交篩選紅茶菌三株菌最適復(fù)配比優(yōu)化培養(yǎng)紅茶菌時間、溫度、加糖量和裝液量等條件。

1.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用WPS電子表格對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表處理。

2結(jié)果與分析

2.1制備綠茶發(fā)酵基液

綠茶液發(fā)酵基液制備：蔗糖（白砂糖）5%，綠茶和水比例為1：150，將水煮沸，在100°C水中加入蔗糖及茶葉煮沸5min再浸提20min，過濾茶渣，自然pH值，按40%的裝液量分裝備用[8-10]。

2.2篩選紅茶菌各菌種接種量最適復(fù)合配比

試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)，以紅茶菌產(chǎn)品中分離篩選得到的3株菌（按酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌、短桿乳酸菌順序）液體活化菌種為3個因素，分別按1%、2%、3%為3個水平接種量組合接種到綠茶液培養(yǎng)基中，在溫度為30°C條件下靜置培養(yǎng)10d，通過pH降低變化值（△pH值）篩選最適紅茶菌各菌種接種量復(fù)合配比組合。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表2。

紅茶菌各菌種接種量實(shí)際最優(yōu)復(fù)合配比組合為AIB3C3即酵母菌1%，產(chǎn)膜醋酸菌3%，短桿乳酸菌3%，10dpH值降低2.69。但經(jīng)分析得出理論最優(yōu)組合為AjB3C，與實(shí)際操作組合不一致，通過驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：理論組合A.B3C10d△pH值為2.91，比實(shí)際組合pH值多下降0.22。趙文紅4等通過正交試驗(yàn)研究菌種比例對綠茶發(fā)酵液品質(zhì)的影響，接人酵母菌、醋酸菌和乳酸菌量最優(yōu)組合為3%、1%、3%。左勇中等將分離篩選得到的乳酸菌、醋酸菌和酵母菌進(jìn)行配比得到紅茶菌復(fù)合菌種，結(jié)果表明，乳酸菌、醋酸菌、酵母菌按質(zhì)量配比2：2：1，即總接種量5%，在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中發(fā)酵效果最好。馬騁[5]等采用自行分離純化的酵母菌Y1、乳酸菌R3、醋酸菌C5進(jìn)行純種混合發(fā)酵生產(chǎn)紅茶菌飲料，結(jié)果表明，酵母菌：醋酸菌：乳酸菌的比例是1：1：2，接種量為5%紅茶菌的發(fā)酵效果最好。紅茶菌單一菌種復(fù)合配比雖各不同，但總接種量均為5%左右，本研究根據(jù)正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果選用紅茶菌單一菌種接種量最適復(fù)合配比為酵母菌1%，產(chǎn)膜醋酸菌3%，短桿乳酸菌1%，可見與上述研究均不同，這可能是菌株種類及菌種來源不同而有所差異的原因，但總接種量亦為5%，由正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)膜醋酸菌對紅茶菌生長影響最大，其次是酵母菌，而短桿乳酸菌影響最小。見表2。

2.3優(yōu)化紅茶菌復(fù)合菌種各培養(yǎng)條件

2.3.1培養(yǎng)時間

按最佳接種量組合接種至綠茶液培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)，0、2、4、6、8、10、12d分別觀察菌膜情況及取樣測定pH值、總活菌數(shù)，以確定紅茶菌最佳培養(yǎng)時間，見表3。

隨著時間的延長，紅茶菌在培養(yǎng)初期1～6d，pH值明顯降低，培養(yǎng)6d后菌液表面形成成片菌膜;培養(yǎng)6～8dpH值趨于穩(wěn)定，菌膜厚度逐漸增厚變光滑，第8d菌數(shù)達(dá)到峰值;8d后pH值變化不大，有新的菌膜生成但厚度增加不明顯，菌液活菌數(shù)逐漸減少。廖盧燕等以研究紅茶菌發(fā)酵液與菌膜中主要微生物的數(shù)量變化結(jié)果表明，通常紅茶菌菌液中的醋酸菌和酵母菌數(shù)量都要比紅茶菌菌膜中的數(shù)量多，培養(yǎng)初期酵母菌和醋酸菌的數(shù)量基本上都呈上升的趨勢，發(fā)酵6～8d后數(shù)量不斷慢慢下降。因此本實(shí)驗(yàn)選擇紅茶菌最佳培養(yǎng)時間為8d。見圖1。

2.3.2培養(yǎng)溫度

按最佳接種量組合接種紅茶菌至綠茶液培養(yǎng)基中，分別在25、28、30、33、36°C溫度條件下，培養(yǎng)8d，分別觀察菌膜情況及取樣測定pH值、活菌數(shù)，以確定最佳培養(yǎng)溫度，見表4。

培養(yǎng)溫度為28°C時，總活菌數(shù)最多，pH值也相對較低，但其菌膜并未成片生成，分析其原因是酵母菌和乳酸菌在培養(yǎng)前期生長均比較旺盛，菌液活菌數(shù)增多，而其中乳酸菌的大量繁殖使pH值降低，在一定程度上又抑制產(chǎn)膜醋酸菌生長，導(dǎo)致菌膜生成速度變慢;在30°C溫度條件下培養(yǎng)，菌膜表面光滑厚度可達(dá)3.73mm，pH最低為2.74，總活菌數(shù)略少于28°C培養(yǎng)，說明在此溫度下酵母菌大量繁殖其代謝產(chǎn)物促進(jìn)了產(chǎn)膜醋酸菌生長，菌膜大量形成，將菌液中的部分活菌包埋及菌體自身形成菌膜導(dǎo)致菌液中的總菌數(shù)減少，隨著菌膜厚度增厚，菌液環(huán)境更適合兼性厭氧菌短桿乳酸菌生長，菌液pH值降低明顯;33°C和36°C2個溫度條件下，紅茶菌也可以生長，但通過觀察測定菌膜、pH值及總活菌數(shù)3個指標(biāo)比較均不如30°C培養(yǎng)好。綜合3個測定指標(biāo)，為了更有利于紅茶菌互生互利生長，篩選紅茶菌最佳的培養(yǎng)溫度為30°C。見表4。

2.3.3加糖量

分別添加蔗糖（白砂糖）量為0%、2%、4%、8%、10%、12%配制綠茶液培養(yǎng)基，自然pH值，按40%裝液量分裝后接種最佳接種量組合菌種，溫度30°C條件下培養(yǎng)8d，分別觀察菌膜情況、pH值降低變化值（△pH值）及總活菌數(shù)，以確定最佳加糖量。見表5。

白砂糖的添加量小于10%時，隨著加糖量不斷增多，紅茶菌復(fù)合菌菌液的pH值降低變化比較明顯，當(dāng)加糖量為8%時，菌膜表面光滑厚度達(dá)1.58mm，pH值降低變化值達(dá)到峰值，總活菌數(shù)最多。進(jìn)一步增大加糖量達(dá)10%～12%，菌膜生成情況變差，其pH值降低程度與8%相差不大，總活菌數(shù)均低于8%的加糖量。試驗(yàn)結(jié)果說明蔗糖（白砂糖）添.加量適宜可以促進(jìn)紅茶菌生長繁殖，添加量過低則菌體不長或繁殖緩慢，過高反而會抑制生長，因此確定綠茶液中最適加糖量為8%。見表5。

2.3.4裝液量的影響

在250mL三角瓶中分別裝人綠茶液培養(yǎng)基的量為20%、40%、60%、80%，按最佳接種量組合接種至加糖量為8%的綠茶液培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)8d，分別觀察菌膜情況、pH值降低變化值（△pH值）及菌數(shù)，以確定最佳裝液量。見表6。

按不同裝液量在250mL三角瓶中裝入綠茶培養(yǎng)基培養(yǎng)紅茶菌，當(dāng)裝液量為60%時，其菌膜表面光滑且厚度最厚，pH值的降低幅度最大，菌液中的總活菌數(shù)也最多，生長狀況最佳，而裝液量過少或者過多都影響菌膜生成及菌體生長。童婕好[11]等對夏秋茶發(fā)酵紅茶菌的初步探究結(jié)果表明，以容量600mL計(jì)算，控制每瓶裝液量為400mL，菌種平緩地進(jìn)行發(fā)酵作用，可控性較高，因此在66.67%裝液量條件下，最為適宜。喬宏萍[2]等研究不同發(fā)酵體積對紅茶菌酸度、菌膜以及口味的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，150mL鹽水瓶中裝不同體積的茶糖水進(jìn)行發(fā)酵，在裝液量為75mL時（即裝液量50%），無論從酸度還是口感都不錯，各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)達(dá)到平衡，酸度和口味達(dá)到最佳。但是發(fā)酵體積越小，也就是瓶中的空氣量越多，菌膜越厚，發(fā)酵體積越大，菌膜越少，發(fā)酵時間越長。左勇[1等研究裝液量對紅茶菌發(fā)酵的影響結(jié)果表明，當(dāng)裝液量為40%時，菌體生長狀況最佳，而裝液量過多或過少，都不利于菌體生長。可能是因?yàn)檠b液量過少時，營養(yǎng)物含量低，不利于菌種的生長和酶的合成;裝液量過多，環(huán)境含氧量低，不利于氧氣的供給，也不利于菌體的生長繁殖和代謝。本研究最佳裝液量為60%，在上述研究范圍內(nèi)。

3結(jié)論

（1）通過本研究所得結(jié)果分析，紅茶菌復(fù)合菌種最佳接種酵母菌、產(chǎn)膜醋酸菌和乳酸菌的量分別為1%、3%、1%，即總接種量5%。

（2）優(yōu)化紅茶菌復(fù)合菌種在綠茶液中培養(yǎng)的最適條件：培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間8d，最適加糖量為8%，裝液量60%。

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